GB/T 34750-2017 副猪嗜血杆菌检测方法

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中华人民共和国国家标准

GB/T34750—2017

副猪嗜血杆菌检测方法

Detectionmethodsforhaemophilusparasuis

2017-11-01发布2018-05-01实施

发布

GB/T34750—2017

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本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国农业部提。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。

本标准起草单位:河南省动物疫病预防控制中心、河南省农业科学院畜牧兽医研究所、河北农业大

学动物科技学院、山东省农业科学院畜牧兽医研究所。

本标准起草人:吴志明、闫若潜、张健、赵明军、赵雪丽、宋勤叶、徐引弟、王东方、王淑娟、安春霞、

刘梅芬、张盼盼、谢彩华、高凤山、方先珍、吴家强、拜廷阳、王一、刘淑敏。

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GB/T34750—2017

副猪嗜血杆菌检测方法

1范围

本标准规定了副猪嗜血杆菌的分离与鉴定、巢式PCR检测和实时荧光PCR检测方法。

本标准适用于对猪的肺脏、心脏、脑等组织，胸腔、腹腔、心包积液或关节液，抗凝血，细菌培养物等

样品中副猪嗜血杆菌的检测。

2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

bp：碱基对(BasePair)

DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)

dNTPs:脱氧核糖核昔三磷酸(DeoxyribonucleosideTriphosphates)

MGB：小沟结合(MinorGrveBinder)

NAD：烟酰胺腺瞟吟二核昔酸(NicotinamideAdenineDinucleotide)

PES：磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution)

PCR：聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)

Taq酶：TaqDNA聚合酶(TaqDNAPolymerase)

TE：Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTABuffer)

TSA：胰蛋白豚大豆琼脂(TrypticSoyAgar)

TSB：胰蛋白腺大豆肉汤(TrypticSoyBroth)

3仪器

3.1生物安全柜。

3.2恒温培养箱。

3.3光学显微镜。

3.4全自动微生物鉴定仪。

3.5PCR扩增仪。

3.6高速冷冻离心机(12OOOXg以上)。

3.7核酸电泳仪和水平电泳槽。

3.8恒温水浴锅。

3.9单道微量移液器(0.5#L〜10ptL；2〜20pL；20〜200卩L；100〜1000#L)。

3.10组织匀浆器或研钵。

3.11凝胶成像系统(或紫外投射仪)

3.12实时荧光定量PCR仪。

4耗材

4.11.5mL无菌离心管。

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GB/T34750—2017

4.20.2mLPCR薄壁管或八联管。

5试剂

5.1TSA培养基和TSB培养基（见附录A）。

5.2NAD贮存液（见附录A）,2°C〜8C条件下保存。

5.3革兰氏染色试剂：含草酸鞍结晶紫染液、卢戈氏（Lugol）碘液、95%乙醇和沙黄（蕃红）染液，常温条

件下保存。

5.4葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、木糖等微量生化鉴定管，2°C〜8°C条件下保存。

5.53%过氧化氢、0.8%磺胺酸冰醋酸溶液、0.5%a-蔡胺乙醇溶液,0.1%盐酸二甲基对苯二胺（见附录

A）,常温条件下保存。

5.6消化液I和TE缓冲液（见附录B）,常温条件下保存。

5.71XTAE核酸电泳缓冲液、酚-氯仿-异戊醇混合液（25+24+1）,0.01mol/L（pH7.2）的PES、阿氏

液等试剂（见附录B）,6X电泳上样缓冲液，75%乙醇，以上试剂2°C〜8C条件下保存。

5.8组织悬液、消化液H（见附录B）,异丙醇,DNA标准分子量，置一20°C保存。

5.9阳性对照、阴性对照（见附录B）

5.10巢式PCR扩增用上、下游引物序列（见附录C）。

5.11副猪嗜血杆菌巢式PCR检测反应体系（见附录D）。

5.12副猪嗜血杆菌实时荧光PCR扩增用上、下游引物及探针序列（见附录C）。

5.13副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测反应体系（参见附录E）

6细菌分离与鉴定

6.1样品的采集

无菌采集疑似副猪嗜血-杆菌感染病死猪的肺脏、心脏、脑等新鲜组织，胸腔、腹腔、心包积液或关节

液，抗凝血等样品。采集或处理的样品在2°C〜8°C条件下保存应不超过24h。采集的样品密封后，采

用保温壶或保温桶加冰密封，运送到实验室。

6.2分离培养

6.2.1在生物安全柜中用接种坏无菌蘸取样品划线接种于TSA固体培养基上,37°C培养24h〜48h,

使之形成菌落，以供鉴定用。

6.2.2取6.2.1中培养的针尖大小（直径约1rrnn〜2mm）.圆形、隆起、光滑湿润、无色透明、边缘整齐

的小菌落，在TSA固体培养基上进行划线接种纯培养,37°C培养24h〜48h后，出现上述小菌落。

6.3涂片染色镜检

6.3.1涂片在载玻片上滴加1〜2滴灭菌蒸憾水后，挑取纯培养的小菌落与灭菌蒸憎水混匀并涂成薄

菌膜。

6.3.2干燥将涂片于空气中自然晾干。

6.3.3固定将已干燥的载玻片涂面朝上，在酒精灯火焰上通过5次〜6次进行固定。

6.3.4染色采用革兰氏染色法进行染色，具体操作按照革兰氏染色试剂盒说明书进行，置1000倍

（10X100）光学显微镜下观察。

6.3.5镜检副猪嗜血杆菌为革兰氏染色阴性短杆状或球杆状小杆菌，菌体大小不等，约0.5MmX

（1.5pm〜2.0pm）,以纤细杆状居多、无鞭毛，不形成芽抱。

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6.4“卫星生长现象”试验

在生物安全柜中无菌挑取纯化培养后的单个菌落，平行划线于无NAD的绵羊鲜血平板上，再挑取

金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线,37°C条件下培养24h〜48h后，观察菌落生长情况，副猪嗜血杆

菌无溶血，并具有“卫星生长现象”（金黄色葡萄球菌周围的副猪嗜血杆菌菌落较大.而远离葡萄球菌的

副猪嗜血杆菌菌落较小）。

6.5增殖培养

在生物安全柜中无菌挑取具有“卫星生长现象”且不溶血的单菌落在TSA固体培养基上进行再次

纯培养后，挑取单个菌落接种于5mLTSB液体培养基中，37°C培养24h〜48h后，液体变混浊，判为

增殖培养成功。

6.6生化鉴定

6.6.1糖类发酵试验

在生物安全柜中无菌将生化鉴定管打开，每管按10Mg/mL终浓度加入NAD,用接种针无菌挑取

6.5中增殖培养的菌液分别接种于葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、木糖等微量生化鉴定管中，37°C培养

24h,观察结果，发酵葡萄糖、半乳糖，不发酵乳糖、甘露醇、木糖者为阳性，否则为阴性。

6.6.2触酶试验

吸取6.5中增殖培养的菌液1滴于洁净玻片上，然后滴加1滴3%过氧化氢混匀，30s内观察反应

结果，立即出现大量气泡者判为阳性，无气泡者判为阴性。

6.6.3硝酸盐还原试验

将0.8%磺胺酸冰酷酸溶液和0.5%a-荼胺乙醇溶液各0.2mL混合，取混合试剂0.1mL加至6.5

中增殖培养菌液中，立即观察结果，呈现红色者为阳性，无红色出现者为阴性。

6.6.4尿素酶试验

吸取6.5中增殖培养的菌液100卩L接种于尿素酶试验液体培养基管中，摇匀，于37°C培养

10min,60min和120min后分别观察结果，粉红色者判为阳性，不变色者判为阴性。

6.6.5氧化酶试验

吸取6.5中增殖培养菌液1滴于洁净载玻片上，加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴，2min内观察结

果，呈现鲜蓝色者判为阳性，2min内不变色者判为阴性。

6.6.6全自动微生物鉴定仪鉴定

按照全自动微生物鉴定仪使用说明书将6.5中增殖培养的细菌进行微生物鉴定。

6.6.7结果判定

糖类发酵试验结果为发酵葡萄糖、半乳糖，不发酵乳糖、甘露醇、木糖;触酶、硝酸盐还原试验结果均

为阳性;尿素酶、氧化酶试验结果均为阴性的判定为副猪嗜血杆菌阳性；或全自动微生物鉴定仪鉴定结

果为副猪嗜血-杆菌阳性的，判定为副猪嗜血杆菌阳性。

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7副猪嗜血杆菌巢式PCR检测

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