GB/T 18936-2020 高致病性禽流感诊断技术

ICS11.220

B41GB

中华人民共和国国家标准

GB/T18936-2020

代替GB/T189362003

高致病性禽流感诊断技术

Diagnostictechniquesforhighlypathogenicavianinfluenza

2020-12-14发布2020-12-14实施

国家市场监督管理总局申＃

国家标准化管理委员会保叩

GB/T18936-2020

目次

前言…………·”………I

1范围…

2规范性引用文件…

3术语和定义

4临床诊断………………·……”……”.••.••••••••••••2

5样品采集、保存与运输…………·……”………...••••••••••••2

6病毒分离与鉴定………·……”……”……..3

7血凝和血凝抑制试验……·……”……”……..3

8禽流感病毒RTPCR试验………”……”……..4

9禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验………””……..5

10综合判定……··……”……………..6

附录A（规范性附录〉试验所用溶液和1%鸡红细胞的配制…”……..7

附录B（资料性附录〉高致病性禽流感病毒IVPI测定试验……”……”……..8

附录c（资料性附录）血清非特异性凝集和非特异性抑制因子的处理方法………10

附录D（资料性附录〉禽流感病毒RT-PCR试验用引物……”…·…12

附录E（资料性附录〉RT-PCR反应液配和l……·……”…·……13

附录F（资料性附录〉实时荧光RT-PCR引物探针序列及反应液配方…”…….14

GB/T18936-2020

前言

本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。

本标准代替GB/T18936-2003《高致病性禽流感诊断技术》，与GB/T18936-2003相比，主要技

术变化如下2

一一增加了禽流感病毒RT-PCR试验（见第B章）;

一一增加了禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验（见第9章）•

删除了琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验（见2003年版的第4章）;

删除了间接酶联免疫吸附试验(ELISA）（见2003年版的第5章）。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。

本标准起草单位z中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中华人民共和国北京海关、中国动物卫生与

流行病学中心。

本标准主要起草人z王秀荣、田国彬、刘环、邓国华、蒋文明、施建忠、曾显营、李雁冰、谷强、列晓东、

陈化兰。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为2

一一－GB/T18936-2003。

I

GB/T18936-2020

高致病性禽流感诊断技术

1范围

本标准规定了高致病性禽流感临床诊断，样品采集、保存与运输，病毒分离与鉴定，血凝和血凝抑制

试验，禽流感病毒RT-PCR试验和禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验的技术要求。

本标准适用于高致病性禽流感的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单〉适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T765高致病性禽流感样品采集、保存及运输技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

高致病性禽流感highlypathogenicavianinflne皿a;HPAI

由正秸病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类为主的急性传染病。

3.2

血凝hemagi且ntinin;HA

流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白，具有识别红细胞表面受体并使红细胞凝集的特性。

3.3

血凝抑制hemagglutinininhihition;HI

抗体特异性地附着在HA分子的抗原位点上，干扰流感病毒HA与红细胞受体之间的结合，抑制

了流感病毒HA凝集红细胞的能力。

3.4

反转录聚合酶链式反应reversetranscription-polymerasechainreaction;RT-PCR

一种用于放大扩增特定的RNA片段的分子生物学技术。先用RNA反转录为cDNA，然后以

cDNA为模板进行PCR扩增的过程。

3.5

实时荧光RT－配Rreal-timeRT－配R

利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程的一种扩增核酸方法。

3.6

Ct值cycleth瞄hold

每个反应管内的荧光信号量达到设定的阕值所经历的循环次数。

1

GB/T18936-2020

4临床诊断

4.1易感动物

鸡、火鸡、鸭、鹅、鹊鸦、维鸡、鹏鸪、驼鸟、孔雀等多种禽类易感，多种野鸟也可感染发病因

4.2临床症状

4.2.1精神沉郁，嗜睡，头翅下垂，呆立g食欲不振z呼吸困难，有呼吸道症状。

4.2.2鸡冠发钳、发紫z眼结膜发红g排黄、白、绿色稀便，并有未完全消化的饲料s脚鳞或有出血。

4.2.3产蛋下降，软壳蛋、畸形蛋增多e有歪脖子等神经症状。

4.2.4鸭、鹅等水禽可见神经和腹泻症状g有时可见角膜发红、充血、有分泌物，甚至失明。

4.3剖栓变化

4.3.1气管弥漫性充血、出血，有少量秸液；肺部有炎性症状。

4.3.2腹腔有挥浊的炎性分泌物；肠道可见卡他性炎症；输卵管内有浑浊的炎性分泌物，卵泡充血、出

血、萎缩、破裂，有的可见“卵黄性腹膜炎”g膜腺边缘有出血、坏死。

4.3.3心冠及腹部脂肪出血g腺胃乳头可见出血s盲肠扁桃体肿大出血g直肠秸膜及泄殖腔出血。

4.4结果判定

出现4.2、4.3中的情况，初步判为高致病性禽流感临床疑似病例，需要进一步开展实验室诊断。

5样晶采集、保存与运输

5.1总则

样品采集、保存及运输应按照NY/T765进行。样品采集宜在发病初巍、选择具有典型临床症状的

禽进行，采样过程中应避免交叉污染．死禽或其他动物采集气管、肺和脑等组织样品，进行分别处理z活

禽样品应包括咽喉和／或泄殖腔拭子s小珍禽用拭子取样易造成损伤，可采集新鲜粪便。

5.2拭子样晶

5.2.1采集咽喉拭子时将拭子深入喉头及上领裂来回刮2次～3次并旋转，取分泌液。

5.2.2采集泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔至少旋转3围并沾取少量粪便。

5.2.3将采样后的拭子分别放入盛有1.2mL样品稀释液〈配制方法见附录A中的A.1)的2mL采样

管中，编号并填写相应采样单。

5.3组织样晶

发病禽鸟可元菌采集气管、肺、脑、肠（包括内容物）、肝、脾、肾、心等组织脏器，装入15mL或

50mL带螺口的有机材料保存管中，编号并填写相应采样单。

5.4血清样晶采集

元菌采集禽类的血液，每只约2mL，编号并填写相应采样单e待血液凝固，血清析出后，收集血清

用于HI检测。

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GB/T18936-2020

5.5样晶保存和运输

样品采集后置保温箱中，加人预冷的冰袋，密封，宜24h内送实验室。样品应尽快处理，没有条件

的可在4℃存放不超过4d，也可在低温条件下保存〈一70℃贮存为宜λ

6病毒分离与鉴定

6.1适用范围

病毒分离与鉴定方法适用于对HPAI的病原学诊断，应在有资质的高等级生物安全实验室操作，

按照GB19489的规定执行。

6.2样晶处理

将棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子z粪便、研碎的组织加样品稀释液充分研磨，按照1g组织加

10mLPBS的比例配成悬液。样品液经3000r/min离心10min，取上清作为接种或者核酸检测材料。

6.3样晶接种及收获

取处理好的样品，以0.2mL／胚的量经尿囊腔途径接种9d~11d元特定病原体鸡胚，每个样品接

种3～5枚鸡胚，在37℃孵化箱内孵育，每天上午和下午定点观察鸡胚死亡情况。无菌收取死胚及96h

仍存活鸡胚的鸡胚尿囊液，测HA活性。

6.4病毒鉴定

若无HA活性，则收取尿囊液进行盲传，至少盲传1代，若仍阴性，则认为病毒分离阴性z若有HA

活性说明可能有正教病毒科的流感病毒，可进一步采用血凝和血凝抑制试验〈见第7章）、高致病性禽流

感病毒IVPI（静脉内接种致病指数）测定试验（参见附录B）、禽流感病毒RTPCR试验（见第8章〉、禽

流感病毒实时荧光RTPCR试验（见第9章〉等方法进行验证．

7血凝和血凝抑制试验

7.1适用范围

血凝和血凝抑制试验适用于血凝素亚型的诊断和抗体效价测定。

7.2试剂

7.2.1阿民（Alsevers）液，配方参见A.2"

7.2.21%鸡红细胞悬液，配方参见A.3"

7.2.3pH7.2、0.01mol/LPBS，配方参见A.4"

7.2.4禽流感病毒血凝素分型标准抗原、标准阳性血清、阴性血清。

7.3HA试验（微量法〉试验步骤

7.3.1在96孔V型微量反应板中，每孔加0.025mLPBS0

7.3.2第1孔加0.025mL抗原或病毒液，反复吹吸3次～5次混匀。

7.3.3从第1孔吸取0.025mL抗原或病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，进行2倍

系列稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃去。第12孔为PBS对照孔。

3

GB/T18936-2020

7.3.4每孔加0.025mLPBS。

7.3.5每孔加入0.025mL1%（体积分数〉鸡红细胞悬液。

7.3.6结果判定。轻扣反应板混合反应物，室温（约20℃）静置40min，环境温度过高时可在4℃条件

下静置60min，当对照孔的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。判定时，将反应板倾斜60℃，观察红细

胞有无泪珠状流淌，完全无泪珠样流淌(100%凝集）的最高稀释倍数判为血凝效价。

7.4HI试验（微量法）试验步骤

7.4.1根据HA试验测定的效价配制4个血凝单位（即4HAU）的病毒抗原.4HAU抗原应根据检验

结果调整准确。

示!§IJz如果血凝的终点滴度为1'256(2＇或8log2〕，则4HAU~256/4~64(即＇I'64）；取PBS6.3mL，加抗原

0.1mL，即通过1'64稀释获得4HAU.配制的4HAU抗原需检查血凝价是否准确，将配制的4HAU抗原进行系列

稀释，使最终稀释度为1'2、1'3、1'4、1'5、1'6和1'7.从每一稀释度中取0.025mL，加入PBS0.025mL，再加入

1%鸡红细胞悬液0.025mL，混匀．将血凝板在室温（约20℃）条件下静置40min或4℃60min，如果配制的抗原液为

4HAU，则1•4稀释度将出现凝集终点，如果高于4HAU，可能1'5或I'6为终点，如果低于4HAU，可能1'Z或

1'3为终点。

7.4.2第1孔～第11孔加入0.025mLPBS，第12孔加人0.05mLPBS作为空白对照。

7.4.3第1孔加入0.025mL血清（鸭、鹅血清在检测时建议进行预处理，参见附录C）；第1孔血清与

PBS充分混匀后吸取0.025mL于第2孔，依次2倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。第

11孔作为抗原对照．

7.4.4第1孔～第11孔均加人0.025mL4HAU抗原，在室温（约20℃）下静置30min或4℃

60mm

7.4.5每孔