DB45/T 2138-2020 水体中诺如病毒的核酸检测方法 实时荧光RT-PCR法

ICS11.020

C5151C

DB45

广西壮族自治区地方标准

DB2138—202045/T

水体中诺如病毒的核酸检测方法水体中诺如病毒的核酸检测方法

实时荧光RT-PCR法

Detectionofnorovirusnucleotideacidinwater—Real-timeRT-PCRRT-PCRReal-timewater—inacidnucleotidenorovirusofDetection

2020-07-24发布2020-08-20实施

广西壮族自治区市场监督管理局发布

DB45/T2138DB45/T—2020

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。1.1—2009给出的规则起草。本标准按照GB/T

本标准由广西壮族自治区卫生健康委员会提出并宣贯。

本标准由广西壮族自治区卫生技术标准委员会归口。

本标准起草单位：广西壮族自治区疾病预防控制中心。

本标准主要起草人：刘巍、邓丽丽、谭冬梅、马宇燕、钟革、李秀桂。

Ⅰ

水体中诺如病毒的核酸检测方法实时荧光水体中诺如病毒的核酸检测方法RT-PCR法

11范围

本标准规定了水体中诺如病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。本标准规定了水体中诺如病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。

本标准适用于广西区域内地表水、地下水、集中式供水、娱乐用水、污水等水体中基因Ⅰ组和基因

Ⅱ组诺如病毒的检测。

22术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.12.1

诺如病毒NorovirusNorovirus诺如病毒

世界范围内引起急性胃肠炎暴发和散发的重要病原体。大多数诺如病毒引起的水源性暴发疫情是由

于饮用水或生活用水被污染所致。诺如病毒属于人类杯状病毒科的诺如病毒属，是一组形态相似、抗原

性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径26nm～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称。诺

如病毒基因组是单股正链RNA，全长7.5kb～7.7kb，根据基因特征，诺如病毒被分为6个基因组

（genogroup，ＧⅠ～ＧⅣ），ＧⅠ和ＧⅡ是引起人类急性胃肠炎的两个主要基因组，ＧⅣ也可感染人，

但很少被检出。

2.22.2

实时荧光逆转录-聚合酶链式反应Real-timeRT-PCRRT-PCRReal-time实时荧光逆转录-聚合酶链式反应

在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值对模

板进行定性。

2.32.3

CtvaluethresholdCycle值

每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。各模板的Ct值与该模板的起始拷贝

越小。反之亦然。数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值

33原理

水样在通过带负离子混合纤维素膜时，带正离子的病毒被吸附到膜上，聚乙然后再洗脱病毒，并用

二醇沉淀病毒达到富集浓缩的效果。应用实时荧光RT-PCR技术，针对诺如病毒衣壳蛋白区N/S区设计特

异性引物和探针，荧光探针的5’端’端标记报告荧光基团，3标记淬灭荧光基团，当探针完整时，报告

PCR扩增时，T荧光基团的发射波长被淬灭荧光基团的激发波长吸收；当aq酶的5’→3’端外切酶活性将

探针酶切水解，报告荧光不再受淬灭荧光的影响，使荧光监测系统收集到报告基团的荧光信号，即每扩

增一条DNA链，可产生一个报告基团的荧光信号，实现荧光信号积累与PCR产物形成同步。

44试剂和耗材

4.14.1试剂

4.1.14.1.1除另有说明外，本文件所使用的试剂均为分析纯，分子生物学试剂所用水为无RNA酶的水。

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DB45/T2038DB45/T—2020

4.1.24.1.22.5mol/L氯化镁（MgCl2）溶液，配制遵照附录A中的A.1执行。

4.1.34.1.33％牛肉浸膏洗脱液，配制遵照附录A中的A.2执行。

4.1.44.1.416％PEG8000溶液，配制遵照附录A中的A.3执行。

4.1.54.1.50.2mol/L的Na2HPO4溶液，配制遵照附录A中的A.4执行。

4.1.64.1.61mol/L盐酸溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、RNA提取试剂盒、实时荧光RT-PCR试剂盒。

4.1.74.1.7引物和探针。工作浓度均为10μmol/L-20，℃保存，引物和探针序列见表1。

表1表1实时荧光引物和探针序列表

基因组引物/探针序列

JJV1F(上游引物)5'-GCCATGTTCCGITGGATG-3'

GⅠJJV1R(下游引物)5'-TCCTTAGACGCCATCATCAT-3'

JJV1P(探针)5'-FAM-TGTGGACAGGAGATCGCAATCTC-BHQ-3'

JJV2F(上游引物)5'-CAAGAGTCAATGTTTAGGTGGATGAG-3'

GⅡCOG2R(下游引物)5'-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3'

RING2(探针)5'-FAM-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ-3'

4.24.2耗材

包括以下物品：

——混合硝酸纤维素膜，孔径0.45μm；

——快速定性滤纸；

——