DB43/T 2812-2023 普通丝瓜杂交种纯度鉴定（SSR法）技术规程

ICS67.080.20

CCSB31

43

湖南省地方标准

DB43/T2812—2023

普通丝瓜杂交种纯度鉴定（SSR法）技术

规程

Codeofpracticeforpurityidentificationofspongegourdhybrid(SSRmethod)

2023-11-09发布2024-02-09实施

湖南省市场监督管理局发布

DB43/T2812—2023

目次

前言II

1范围1

2规范性引用文件1

3原理1

4主要仪器设备、试剂耗材1

5试剂配制2

6引物2

7鉴定流程2

8纯度计算3

附录A（资料性）常用试剂配方5

附录B（资料性）引物信息7

I

DB43/T2812—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由湖南省农业农村厅提出。

本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。

本文件主要起草单位：湖南省蔬菜研究所、长沙市农业科学研究院、长沙县农业局、岳阳市农业科

学研究院，湖南湘妹子农业科技有限公司。

本文件起草人：韩小霞、胡新军、闵子扬、李勇奇、邓稳桥、卢亚楠、刘昆言、粟建文。

II

DB43/T2812—2023

普通丝瓜杂交种纯度鉴定（SSR法）技术规程

1范围

本文件规定了丝瓜杂交种纯度鉴定的主要仪器设备、试剂耗材、试剂配制、引物、鉴定流程和纯度

计算。

本文件适用于普通丝瓜杂交种纯度鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

3原理

SSR标记技术是一种以特异引物PCR扩增为基础的分子标记技术。由于SSR标记广泛存在于植物基因

组上，不同材料每个位点重复单位的数量及序列可能不同，故而形成扩增片段的长度多态性。根据扩增

片段电泳谱带的差异，可鉴定杂交种纯度。

4主要仪器设备、试剂耗材

主要仪器设备

研钵、镊子、电子天平（精度值为0.001）、高速台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、PCR

扩增仪、电泳仪、垂直电泳槽、凝胶成像系统、酸度计、微量移液器、摇床、高压灭菌锅、通风柜、胶

片观察灯、数码相机、4℃冰箱和-20℃冰箱。

主要试剂

乙二胺四乙酸二钠（Ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt，EDTA-2Na）、盐酸（HCl）、

氢氧化钠（NaOH）、三羟甲基氨基甲烷【Tris(hydroxymethyl)methylaminomethane，Tris）】、三

氯甲烷(Chloroform)、十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfonate，SDS）、乙醇（Ethanol）、异丙

醇（Isopropanol）、异戊醇（Isoamylalcohol）、TaqDNA聚合酶、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、

引物、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉双丙烯酰胺（N，N，-methylemebisacrylamide）、四甲基乙

二胺（TEMED）、硼酸（Boricacid）、过硫酸铵（Ammoniumpersulfate）、硝酸银（Silvernitrate）、

冰醋酸（Glacialaceticacid）、醋酸钠（Sodiumacetate）、甲醛（Formaldehyde）、水（H2O）符

合GB-T6682-2016规定。

主要耗材

离心管（0.6ml、1.5ml、2.0ml）、枪头（白枪头、黄枪头、蓝枪头）、枪头盒、48孔板、96孔

PCR扩增板、96孔PCR扩增板管盖、量筒、发芽盒、玻璃板、玻璃棒、一次性手套、一次性口罩。

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DB43/T2812—2023

5试剂配制

相关试剂配制方法见附录A

6引物

部分SSR引物信息见附录B

7鉴定流程

种子催芽

种子扦样参考GB/T3543.2。取丝瓜杂交种约250粒，父母本约各10粒，温汤浸种后，28℃～30℃催

芽至种子露出子叶。

取样

取发芽种子胚轴0.5cm～1cm，用于DNA提取.

DNA提取方法

可采用CTAB小样法或者快速碱煮法提取。

7.3.1CTAB小样法

将丝瓜样品放于研钵中，加入0.8mLDNA缓冲液，研磨均匀，将磨好的样品倒回至2ml离心管，冰

上放置或者放冰箱冷冻。

将研磨好的样品放置于48孔板架上，60℃水浴30min，中间每隔5min摇一次，使样品受热均匀。

取出管架，打开2mL离心管管盖，然后加入0.8mL氯仿:异戊醇（24:1）溶液，颠倒混匀。室温下静置

5cm～10min后10,000rpm离心5min；将上清仔细移至另一2mL离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，

室温静置3min，5,000rpm离心5min，去除上清。用70%的乙醇洗涤沉淀2次，待乙醇全部风干后，加

入500µL60℃预热的ddH2O，再加入5µLRNaseA(10µg/µl)，37℃温浴10min，最后加入1/10体积

的3mol/LNaAc及2×体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20min。5,000rpm离心5min，去上清，用

70%的乙醇洗涤沉淀2次，风干乙醇后加入200µLddH2O。

用紫外分光光度计检测DNA浓度并将DNA溶液用ddH2O稀释到20ng/µL，-20℃冰箱中保存备用。

7.3.2快速碱煮法

将丝瓜胚轴放入96孔PCR板管底部，并加入0.25mol/L的NaOH溶液50µL，用96孔板盖盖好PCR板，

置于沸水中煮3min，最后加入0.1mol/L的Tris﹒HCl(pH=8.0)150µL。

PCR扩增

7.4.1扩增体系

DNA模板约0.5µL，10×Buffer1µL，10mmol/ldNTP0.1µL，10pmol/lSSR引物0.2µL，2.5

U/µlrTaq0.1µL，加灭菌ddH2O至总体积10µL。

7.4.2反应程序

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