GB/T 13091-2002 饲料中沙门氏菌的检测方法

ics07.100.30

B46

中华人民共和国国家标准

GB/T13091一2002

代替GB/T13091-1991

饲料中沙门氏菌的检测方法

DeterminationofSalmonellainfeeds

(ISO6579:1993,Microbiology-Generalguidanceon

methodsforthedetectionofSalmonella,MOD)

2002一09一24发布2003一03一01实施

中华人民共和国

发布

国家质量监督检验检疫总局

GB/T13091-2002

.山J遥~J，.

All胃

本标准代替GB/T13091-1991((饲料中沙门氏菌的检验方法》，因为国际上的发展原标准在技术

上已过时。

本标准修改采用ISO6579:1993((微生物学沙门氏菌检验导则》(英文版)

本标准根据ISO6579:1993重新起草。除增加了资料性附录D,附录E外，本国家标准章条编号与

ISO6579:1993完全一样。

考虑到我国国情，在采用ISO6579:1993时，本标准做了一些修改。有关技术性差异已编人正文中

并在它们所涉及的条款的页边空白处用垂直单线标识。在附录E给出了这些技术性差异及其原因的一

览表以供参考

为便于使用，本标准还做了以下编辑性修改:

a)“本国际标准”一词改为“本标准”;

b)用小数点“’，代替作为小数点的逗号“，”;

c)删除国际标准的前言;

d)标准名称由微“生物学沙门氏菌检验导则”改为饲“料中沙门氏菌的检测方法”。

本标准的附录A、附录B、附录C为规范性附录，附录D、附录E为资料性附录

本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。

本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位:国家饲料质量监督检验中心(北京)。

本标准主要起草人:饶正华、李丽蓓、高生、杨曙明、苏晓鸥。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为:GB/T13091-1991

GB/T13091-2002

饲料中沙门氏菌的检测方法

替告:为保障实验室人员的健康，只有具备适当设备的实验室才能承担沙门氏菌检验。应小心处理

所有培养材料的废弃物。

范围

本标准规定了沙门氏菌检验方法。

本标准适用于饲料中沙门氏菌的检验。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的

修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是

否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB4789.1食品卫生微生物学检验总则

GB/T14699.1饲料采样方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

沙门氏菌Salmonella

检验中，能在选择性固体培养基中形成典型菌落，且生化和血清学鉴定与本标准中描述一致的微

生物

3.2

沙门氏菌的检验detectionofSalmonella

按本标准检验，以确定沙门氏菌在某种产品中存在与否的过程。

4原理

沙门氏菌的检测需要四个连续的阶段(见附录A).

注:样品中可能存在少量的沙门氏菌但却含有大量肠杆菌科的其他菌，因此，选择性增菌是必须的;而且，为了检验

受伤的沙门氏菌，常须进行预增菌

用非选择性液体培养基预增菌

将试料接种到缓冲蛋白陈水，在36'C士1'C下培养16h-20ha

月2

q在选择性液体培养基上增菌

将4.1中的培养物接种到氯化镁一孔雀绿培养基和亚硒酸盐胧氨酸培养基中。

氯化镁一孔雀绿培养基在42C培养24h，亚硒酸盐胧氨酸培养基在36C士1`C培养24h或再延长

n乙4卜

月3

﹃划线及识别

将4.2的培养物接种到以下两个选择性培养基:

一应使用酚红煌绿琼脂培养基，除非国际标准对检样有规定或有特殊考虑(如分离乳糖阳性沙门

氏菌)

GB/T13091-2002

—DHL琼脂培养基(见5.2-4-2).

在36C士1C培养，24h后检查，必要时培养至48h，根据菌落特性，辨别可疑菌落。

4.4鉴定

挑出4.3中的可疑沙门氏菌菌落，再次培养，用合适的生化和血清学试验进行鉴定。

培养基、试剂和血清

5.1总则

微生物实验室的操作，按照GB4789.1进行。

5.2培养基和试剂

注:由于有大量的培养基和试剂可供选择，为明确起见，在附录B中规定了它们的成分和制备方法

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

5.2.1缓冲蛋白陈水(BP):见第B.1章。

5.2.2氯化镁一孔雀绿增菌液(RV):见第B.2章。

5-2.3亚硒酸盐胧氨酸增菌液(SC:见第B.3章。

5.2.4选择性划线固体培养基:

a)酚红、煌绿琼脂:见第B.4章和附录Ca

b)DHI琼脂:见第B.5章。

5.2.5营养琼脂:见第B.6章。

5.2.6三糖铁琼脂(TSI):见第B.7章。

5.2.7尿素琼脂:见第B.8章。

5.2.8赖氨酸脱竣试验培养基:见第B.9章。

5.2.9R一半乳糖昔酶试剂:见第B.12章。

5.2.10V-P反应培养基(见第B.10章):

a)V-P培养基。

b)肌酸溶液

Ca-蔡酚乙醇溶液。

d)氢氧化钾溶液。

5.2-11靛基质反应培养基(见第B.11章):

a)胰蛋白陈色氨酸培养基。

b)柯凡克试剂。

5.2.12半固体营养琼脂:见第B.13章。

5.2-13盐水溶液:见第B.14章。

5.2-14沙门氏菌因子0,Vi,H型血清。

6设备与材料

注3可以用一次性使用的仪器代替可重复使用的仪器。

6-1高压灭菌锅或灭菌箱。

6.2干热灭菌箱:37C士1C-55C士1C,

6.3培养箱:36'C士1'C,

6.442C士1C水浴或42C士0.5C培养箱

6.5水浴:45C士1C，55'C士1C,70C士1C。

6.6水浴:36'C士1C。

6.了接种环:铂铱或镍铬丝，直径约3mm,

GB/T13091-2002

6.8pH仪。

6.9培养瓶或三角瓶。

往:可用无毒金属或塑料螺丝盖的培养瓶或三角瓶

6.10培养试管:直径8mm，长度160mm.

6.11量筒。

6.12刻度吸管。

6.13平皿:皿底直径9cm或14mm,

7采样

实验室样品真实、具有代表性，在运输和贮存过程中没有发生损失或改变是非常重要的。采样方法

可按照国家标准GB/T14699.1进行(器具要经过消毒)。

8试样的制备

将至少2kg具有代表性的饲料样品，四分法缩分至约250g，过40目筛，在密闭瓶中低温保存

9操作步骤(见附录A)

9.1试料和1:10稀释液制备

9.1.1用预增菌液((5.2.1)作为稀释液，来制备1:10稀释液。

9.1.2取试料25g，加人装有225mL缓冲蛋白陈水((5.2.1)的500mL广口瓶内。如果试料量不是

25g，试料质量与预增菌液的体积比应约为1:10.

注1:当检测来自同一特定样品的多个试料时，若有证据表明试料混合不影响检验结果，试料可以混合。例如:若需}

检测10份25Q试料时，混合这10份，形成250a试料，缓冲蛋白陈水用22501。或者从10个单独的试料预}

增菌液中分别取出0.1mL和10-1人RV培养基和亚硒酸盐胧氨酸增菌液中，混合后分别接入0.1L和1L1

选择性增菌培养基中。}

注2:干样和粉状样可能需要特殊的水合过程以提高沙门氏菌的复性。}

9.2非选择性增菌

将增菌液在36C士1'C培养，时间不少于16h，不超过20ho

9.3选择性增菌培养

9.3.1取9.2中获得的预增菌培养物0.1ml，接种于装有10mL氯化镁一孔雀绿增菌液(5.2.2)的试

管中，另取预增菌培养物10ml，接种干装有100ml亚硒酸盐胧氨酸增菌液((5.2.3)培养瓶中

9.3.2接种后两种培养基(9.3.1)的培养条件如下:

a)氯化镁孔雀绿增菌液试管在42'C培养24h,

b)亚硒酸盐胧氨酸培养瓶在36C土1'C培养24h或48h,

注:在某些情况下，可以将亚硒酸盐胧氨酸培养基的培养温度增加至42C。但需在检验报告中提及此改动。

94分离培养和鉴定

9.4.1氯化镁孔雀绿增菌液在培养24h后，分别用接种环划线接种在酚红煌绿琼脂5〔.2.4a)〕平皿

和DHI.琼脂5〔.2.4b)〕平皿上，为取得明显的单个菌落，取一环培养物，接种两个平皿，第一个平皿接

种后，连续在第二个平皿上划线接种。

注:在酚红煌绿琼脂平板上划线时，建议使用以下方法:两个平皿用同一接种环(6.7);按附录D进行划线操作;划

完整个平皿;第一个平皿接种后，不要烧接种环，也不要换接种环当仅用一个平皿时，划线方法按附录D中的

第一个平皿的方法。

9.4.2亚硒酸盐胧氨酸培养瓶在培养24h后，重复9.4.1的操作。

9.4.3将(9.4.1)和((9.4.2)的平皿底部向上，在36'C士1C培养箱中培养。

9.4.4亚硒酸盐胧氨酸培养基((9-3.2和9.4.3)在培养48h后，重复9.4.2和9.4.30

Gs/'r13091--2002

9-4.5培养20h-24h后，检查平皿((9.4.3和9.4.4)中是否出现沙门氏菌典型菌落，生长在、酚红煌

绿琼脂上的沙门氏菌典型菌落，使培养基颜色由粉红变红。

9.4.6如生长微弱，或无典型沙门氏菌落出现时，可在36C士1c重新培养18h-24h。再检验平皿是

否有典型沙门氏菌菌落。

注:任何典型或可疑菌落均应进行鉴定(9.5)辨认沙门氏菌菌落，在很大程度上依靠经验，它们外表各有不同，不

仅是种与种之间，每批培养基之间也有不同，此时可用沙门氏菌多价因子血清，先与菌落作凝集反应，以帮助

辨别可疑菌落

9.4.了在进行沙门氏菌鉴定时，可以使用商业鉴定材料

9.5鉴定

9-5.1鉴定菌落的选择

从每种分离平皿培养基上((9.4.5和9.4.6)，挑取5个被认为可疑菌落。少于5个时，可将全部典型

或可疑菌落供进行鉴定

挑选的菌落在营养琼脂平皿((5.2.5)上划线培养，在36'C士1C培养18h-24h，用纯培养物作生

化和血清鉴定。

9.5.2生化鉴定

将按9.5.1挑选的典型菌落，用接种针接种在9.5.2.1~9.5.2.6培养基上。

9.5-2.1三糖铁培养基((5.2.6)

在琼脂斜面上划线和穿刺，在36C士1C培养24h。培养基变化见表to

表1三糖铁培养基变化表

培养基部位培养基变化

黄色乳糖和蔗糖阳性(利用乳糖或蔗糖)

琼脂斜面

红色或不变色乳糖和蔗糖阴性(不利用乳糖和蔗糖)

底端黄色葡萄糖阳性(发酵葡萄糖)

红色或不变色葡萄糖阴性(不发酵葡萄糖)

琼脂深部

穿刺黑色形成硫化氢

气泡或裂缝葡萄糖产气

典型沙门氏菌培养物，斜面显红色(碱性)，底端显黄色(酸)，有气体产生，有90%形成硫化氢(琼脂

变黑)。

当分离到乳糖阳性沙门氏菌时，三糖铁斜面是黄色的，因而证实沙门氏菌，不应仅仅限于三糖铁培

养的结果((9.5.3)e

9.5.2.2尿素琼脂培养基((5.2.7)

在琼脂表面划线，在36C士1C培养24h，应随时检查，如反应是阳性，尿素极快地释放氨，它使酚

红的颜色变成玫瑰红色至桃红色，以后再变成深粉红色，反应常在2h-24h之间出现。

9.5.2.3L一赖氨酸脱梭反应培养基((5.2-8)

将培养物刚好接种在液体表面之下，在36'C士1C培养24h，生长后产生紫色，表明是阳性反应。

9.5.2.4检查庄半乳糖昔酶的反应((5.2.9)

取一接种环可疑菌落，悬浮于装有0.25mL生理盐水的试管中，加甲苯1滴，振摇混匀，将试管在

36'C士1C水浴锅中放置数分钟，加ONPG试液。.25mL，将试管重新放人36℃士1'C水浴锅中24h，随

时检查，黄色表明为阳性反应，反应常在20min后明显出现。

9.5.2.5V-P反应培养基(5.2.10)

挑取一环可疑菌落，接种在V-P反应培养基5〔.2.10a)〕上，在36C士1C培养24h，取培养物

，2ml于灭菌试管中，加肌酸溶液05.2.10b))2滴，充分混匀后加a-蔡酚乙醇05.2.10OD溶液3滴，

GB/T13091-2002

充分混匀后再加氢氧化钾溶液5〔.2.10d))2滴，再充分振摇混匀，在15min内，形成桃红色，表明为阳

性反应。

9.5-2.6靛基质反应培养基((5.2.11)

取可疑菌落，接种于装有5mL胰蛋白陈色氨酸培养基5〔.2.11a)〕的试管中，在36'C士1C培养

24h，培养结束后，加柯凡克试剂5〔.2.11b)D1m工，形成红色，表明是阳性反应。

9.52.了生化试验

生化试验见表2,

表2生化试验表

可疑菌在培养基上的反应阴性或阳性出现此反应者沙门氏菌株百分率

三糖铁葡萄糖形成酸+