DB34/T 3308-2018 两系杂交水稻种子纯度检测 分子标记法

ICS65.020.99

B05

DB34

安徽省地方标准

DB34/T3308—2018

两系杂交水稻种子纯度检测分子标记法

Protocolforpuritydetectionoftwo-linehybridseeds-molecularmarkermethod

文稿版次选择

2018-12-29发布2019-01-29实施

安徽省市场监督管理局发布

DB34/T3308—2018

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由安徽省种子质量监督检验站提出。

本标准由安徽省动植物检验检疫标准化委员会归口。

本标准起草单位：安徽省种子质量监督检验站、合肥丰乐种业股份有限公司、安徽省种子管理总站、

安徽出入境检验检疫局技术中心。

本标准主要起草人：周桂林、胡晓玲、吴晓亮、曹玉洁、周贤达、张文晓、范家萌、周锐、周红英、

宗凯、张奇、徐丽媛、王凤杰、胡娜、王兆贤、刘根、熊成国、王浩波。

I

DB34/T3308—2018

两系杂交水稻种子纯度检测分子标记法

1范围

本标准规定了两系杂交水稻种子纯度分子标记检测的原理、实验步骤、结果分析和报告。

本标准适用于两系杂交水稻种子纯度鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.1农作物种子检验规程总则

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T1433水稻品种鉴定技术规程SSR标记法

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

bp：basepair，碱基对

CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵

DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸

dNTPs：deoxyribonucleosidetriphosphates，脱氧核苷三磷酸

PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应

SSR：simplesequencerepeat，简单序列重复

Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐热DNA聚合酶

ddH2O：双蒸水（超纯水）

4原理

我国生产上两系水稻的不育基因主要为温敏核不育基因tms5，其次为光敏核不育基因pms1、pms3，

根据其对应的特征标记在品种中的等位基因型，可判断该品种是否为两系杂交水稻或不育系。同时，水

稻的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的重复次数不同的简单重复序列(SSR)，且SSR标记

具有共显性，杂交种子具有双亲等位标记互补带型，针对不同品种筛选其区别于其它品种的特征SSR

标记，通过SSR多态性分析，可判断受检种子是否为杂交种并区别正常个体与异品种个体。本标准综

合利用两系不育基因特征标记和不同品种特征SSR标记，鉴定一定数量送验样品中的正常个体数目或

百分率，从而对整体样品的一致程度作出评价。

1

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5仪器设备

高压灭菌锅、超纯水仪、高速离心机、恒温水浴锅（30℃～100℃）、核酸蛋白测定仪、组织研磨

仪、PCR扩增仪、高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、微量可调加样器（2μL、10μL、100μL、1000

μL）。

6试剂和溶液配制

所用试剂均为分析纯，试剂配制用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求。

6.1试剂

6.1.1DNA提取

十六烷基三甲基溴化铵、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、盐

酸、氢氧化钠、氯化钠。

6.1.2PCR扩增

2+

引物、DNA、dNTPs、Taq酶、10×Buffer缓冲液、ddH2O、和Mg或者Mix反应混合液。

6.1.3PAGE电泳

去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青FF、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸、尿素、亲和硅烷、剥

离硅烷、DNA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛、氢氧化钠。

6.2溶液配制

见附录A。

7实验步骤

7.1取样

从送检样品中分取规定数量的试样，试样采用单个个体独立检测。试样的抽取应有代表性，符合

GB/T3543.2的规定。

试样的检测应设置重复，重复的次数以达到GB/T3543.5规定的容许误差范围内为止，每次重复

的数量应至少含有90粒种子。

7.2DNA提取

7.2.1CTAB法

取待检样品的去壳种子、幼苗或叶片约200～300mg置于2.0mL离心管，充分研磨；每管加入

700µL经65℃预热的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴30min，期间多次颠倒混匀；每管加入等

体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合液，充分混合后静置10min；10000g离心10min，吸取上清液300

µL转移至一新管，加入600µL预冷95％乙醇，颠倒混匀，-20℃冷冻30min；10000g离心10min，

弃上清液，用70％乙醇溶液洗涤2遍；室温自然晾干后，加入超纯水或TE缓冲液400µL，充分溶

解；检测浓度后备用。

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DB34/T3308—2018

7.2.2碱煮法

将种子发芽至幼苗长度达到3cm左右时剪取0.5cm长的幼苗，或将田间植株的叶片剪取0.5

cm×0.5cm大小，放入96孔深孔板中。每孔加入40μL氢氧化钠提取液，沸水加热1min，然后加

入60μLTE缓冲液，沸水加热2min。放在4℃冰箱备用。

7.3PCR扩增

7.3.1DNA样品

在两个96孔PCR扩增板中分别加入待检样品的94个单样DNA和两个对照样品的DNA，对照样

品