DB22/T 1978-2013 野鲤种质鉴定 微卫星法

ICS67.120.30

B50

DB22

吉林省地方标准

DB22/T1978—2013

野鲤种质鉴定微卫星法

IdentificationSpecificationsofWildCarpMicrosatellitesMethod

2013-12-18发布2013-12-31实施

吉林省质量技术监督局发布

DB22/T1978—2013

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林省水利厅提出并归口。

本标准起草单位：吉林省水产科学研究院。

本标准主要起草人：郑伟、闫春梅、毛瑞鑫、陈伟强、王战蔚、王文兰、杜晓燕、李忠强、李秀颖、

常淑芳、李永利。

I

DB22/T1978—2013

野鲤种质鉴定微卫星法

1范围

本标准规定了利用微卫星法进行野鲤种质鉴定技术的试验方法。

本标准适用于鲜活野鲤种质鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

微卫星microsatelites

又称短串联重复序列或简单重复序列（shorttandemrepeats，STRs；simplerepeats，SSRs），以2bp～

6bp的短核苷酸序列为基本单位，呈串联重复状散在分布于生物体基因组中。

3.2

遗传距离geneticdistance

衡量群体间若干性状综合遗传差异大小的指标。按多元统计分析方法计算品种间多个性状基因型值

构成的多维空间的几何距离，就叫作群体间的遗传距离。主要的遗传距离分析方法有：Nei氏标准遗传

距离（Nei’sstandardgeneticdistance）。

4原理

微卫星由核心序列和两侧的侧翼序列所构成，侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一部位，核

心序列重复数的差异则形成微卫星高度的多态性。若某个体基因组中某个微卫星重复单位数相等，该个

体在该座位的基因型为纯合子，否则为杂合子。检测方法是针对微卫星两端的侧翼序列设计引物，对模

板DNA进行PCR扩增，根据结果判断个体基因型，进行统计分析。

5试剂

5.1除非另有说明，所用试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682一级水的要求。

1

DB22/T1978—2013

5.2无水乙醇。

5.3N,N,N′,N′—四甲基乙二胺（TEMED）：4℃保存。

5.4TaqDNA聚合酶：-20℃保存。

5.5分子量标准(Markers)：DL2000。

5.6溴化乙锭（EB）。

5.7琼脂糖。

5.8Tris饱和酚。

5.9300g/L丙烯酰胺溶液：20mL水中融解29g丙烯酰胺，1g甲叉双丙烯酰胺，定容至100mL，4℃

保存。

5.105×Tris硼酸(5×TBE)电泳缓冲液：Tris27g，硼酸13.75g，加蒸馏水400mL溶解后，加入0.5

mol/LEDTA（pH8.0）10mL，补充蒸馏水定容至500mL。

5.11100g/L过硫酸铵：8mL水中溶解1g过硫酸铵，加水至10mL，4℃保存，现用现配。

5.121g/L硝酸银（AgNO3）染色液：将AgNO30.5g溶于超纯水450mL，加ddH2O定容至500mL，

棕色瓶中保存。

5.13裂解液：5g/L十二烷基肌胺酸钠，10mmol/LEDTA（pH8.0），200μg/mL蛋白酶K。

5.14显色液：将NaOH10g，无水Na2CO30.2g，甲醛2mL，溶解于适量蒸馏水中，并定容至500mL，

现用现配。

5.15提取液：Tris饱和酚+氯仿+异戊醇（25+24+1，体积比）。

5.16乙醇溶液：乙醇+水（7+3，体积比）。

5.17dNTP：四种脱氧核苷酸（4×dNTP）；保存条件为-20℃±2℃。

5.18阳性对照品：30尾野鲤DNA提取物，用TE（pH8.0）溶解至50ng/µL，4℃保存备用。

5.19阴性对照品：30尾建鲤DNA提取物，用TE（pH8.0）溶解至50ng/µL，4℃保存备用。

5.20微卫星引物：参见附录A。

6仪器

6.1电子天平：精度0.0001g。

6.2低温高速离心机：最大容量30×1.5ml，最高转速15,300rpm。

6.3单道可调移液器：0.1-2.5μl，2-20μl，20-200μl，100-1000μl。

6.4水浴恒温震荡器：温控范围RT-100℃，控温精度±1℃。

6.5紫外分光光度计：波长范围190nm-1100nm，波长精度±0.8nm。

6.6PCR仪:控温范围4.0-99.9℃。

6.7电泳仪。

6.8凝胶成像分析系统。

7取样

7.1样本要求

用于试验的鲜活鲤鱼样本数量至少30尾。

7.2试样制备

将活体中直接采集的鳞片或鳍条样品浸泡在乙醇溶液中，-20℃保存备用。

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DB22/T1978—2013

8试验步骤

8.1DNA提取

取20mg鳍条加入0.6mL裂解液，55℃温育1-2h，并不时轻摇至组织块完全消化，取上清液用提取

液抽提3次，加入无水乙醇1ml于-20℃过夜沉淀，离心，弃去上清液，再用0℃预冷的乙醇溶液洗

涤1次，自然干燥后加50-100μL1×TE（pH8.0）溶解DNA，4℃保存备用。

8.2DNA测定

8.2.1DNA纯度测定

吸取1