GB/T 19563-2004 大豆种子品种鉴定实验方法 简单重复序列间区法

ICS65.020.01一一

B21翰黔

中华人民共和国国家标准

GBJT19553--2004

大豆种子品种鉴定实验方法

简单重复序列间区法

Experimentalidentificationmethodforvarietyofsoybeanseed-ISSR

2004-06-22发布2004-12-01实施

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GB/T19563-2004

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本标准的附录A为规范性附录。

本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。

本标准起草单位：国家农业标准化监测与研究中心（黑龙江）、黑龙江省质量技术监督局。

本标准主要起草人：王庆贵、徐晶、姜雯、李光宇、石绍业、郝兆军。

GB/T19563-2004

引言

目前，我国农作物种子的鉴定多采用种植鉴定、快速测定法（苯酚染色法、大豆种皮愈创木酚染色

法、高粱种子氢氧化钾一漂白粉测定法、燕麦种子荧光测定法、小麦种子氢氧化钾测定法）、聚丙烯酞胺凝

胶电泳法测定大麦、小麦种子纯度等。这些方法所需的检验周期较长，虽然电泳法所需时间短，但不具

备分子水平鉴定的诸多优点。

随着分子生物学的发展，特别是20世纪90年代以来，分子生物学的相关技术已被广泛应用，其检

测对象为DNA大分子—生物的遗传基础。以DNA为检测对象，具有许多其他检测水平所不具备的

优点：首先，可供探测DNA标记的数量是无限的，这是同工酶技术所无法比拟的；其二，DNA分析技术

不像其他技术那样随组织或发育阶段而异，植物体任何部位、任何时期提供的DNA均可用于分析，其

检测结果都是一样的；第三，DNA分析不受环境影响，其变异只源于等位基因DNA序列的变异，这种

稳定性便于揭示品种间的遗传变异，从而排除了环境变异所造成的表型变异。

基于上述优点，DNA分析技术是农、林、牧、渔等品种鉴定的先进方法。

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大豆种子品种鉴定实验方法

简单重复序列间区法

，范围

本标准规定了大豆种子品种鉴定的实验方法。

本标准适用于利用简单重复序列间区（ISSR）法对大豆种子品种鉴定的实验过程。

2术语、定义和缩略语

2.1术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

2.1.1

聚合酶链式反应polymerasechainreaction

少至一个拷贝的特定碱基顺序的DNA片断在体外花费几个小时即可扩增出数百万个分子的酶催

化反应，即DNA合成反应。

2.1.2

简单皿复序列间区inter-simplesequencerepeat

是在PCR技术基础上发展起来的一种分子标记和检测方法，根据某个简单重复序列（微卫星位点）

设计出一系列特异引物，通过PCR反应扩增微卫星位点间隔的碱基顺序，以检测其扩增片段长度的多

态性。

2.1.3

徽卫星DNAmicrosatelliteDNA

是一类由几个核昔酸（一般为1个～5个）为重复单位的长达几十至几百个核昔酸的串联重复

序列。

2.1.4

核昔酸nucleotide

是构成核酸的基本单元，由三部分组成：五碳糖、磷酸和环状的含氮碱基．

2.1．5

引物primer

一条互补结合在模板DNA链上的短的单链，提供3'-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模

板DNA的互补链。

2.1.6

引物扩增多态性primeramplified州ymorphism

一对引物在两个或两个以上不同材料基因组DNA之间扩增，得到数目不同或长度不同的DNA

片断。

2.2缩略语

下列缩略语适用于本标准。

ISSR简单重复序列间区（Inter-SimpleSequenceRepeat)

PCR聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction)

DNA脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid)

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RNA核糖核酸（RibonucleicAcid)

OD光密度（OpticalDensity)

TBE三经基氨基甲烷一硼酸一乙二胺四乙酸二钠（TrisBoric-acidEDTA)

3实验方法

3.1原理

DNA是生物体的遗传基础，携带所有的遗传物质，从DNA分子水平上进行鉴别是区分物种、品种

甚至个体之间差异最为有效的方法。

利用PCR技术可将DNA片段在短时间内扩增几十甚至几百万倍，从而达到可以检测的目的。

ISSR方法是在PCR技术基础上发展起来的一种检测方法，是根据简单重复序列（微卫星位点）设计出

一系列特异引物，包括双核昔酸、三核昔酸和四核昔酸等为重复单位的微卫星DNA片段（一般为20个

碱基），通过PCR反应扩增微卫星位点及其间隔区，以检测其扩增片段的多态性。

3.2环境条件

a）温度：150C-250C；

b)湿度：相对湿度（RH）不大于50000

3.3仪器

a)PCR扩增仪；

b)紫外分光光度计；

c）高速台式离心机：转速不小于15000r/min;

d)多用电泳仪及水平式电泳槽；

e)紫外透射仪；

f)微量移液器：规格为0.1p.L-2.5p.I_,2jiL^-20fAL,20juL-200jiL,100[LL-1000pL;

g）电子天平：分度值为。.0001g;

h)磁力加热搅拌器；

i)凝胶成像系统；

j）超纯水系统；

k）灭菌锅；

1)酸度计：最大允许误差为士0.1pH;

m）微波炉；

n）恒温水浴锅：最大允许误差为士10C;

a)恒温干燥箱：最大允许误差为士10Co

3.4试剂和耗材

3.4.1试剂

a)TagDNA聚合酶：保存条件为一20℃士20C；

b)10XBuffer：保存条件为一20℃土20C；

c）四种脱氧核昔酸（(4XdNTP)：保存条件为一20℃士21C;

d)Mgt十：保存条件为一20℃士20C；

e)RNA酶（无DNA酶）：保存条件为一20℃士20C；

f）琼脂糖（agarose)；

g）三经甲基氨基甲烷（Tris)：分子式为C,HnNO,;

h）乙二胺四乙酸二钠（EDTANat"2H20)：分子式为CioHiaNZOaNat.2H2O;

i)澳酚蓝（bromphenolbluesodiumsalt)：分子式为C,9HgBr,05SNa;

7）二甲苯青FF(xylenecyanoleFF)：分子式为C2sH27N206S2Na;

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k)8-经基哇琳(hydroxyquinoline)：分子式为C,H,NO;

1）十二烷基磺酸钠（SDS)：分子式为C12H250,SNa;

m)澳化乙锭(EB)：分子式为C21H2oN3Br;

n）异戊醇：分子式为C,Hl,OH;

0）结晶酚(phenol)：分子式为C,H,O，保存条件为一20℃士20C;

P）三抓甲烷：分子式为CHC13，纯度为分析纯；

q)硼酸（boricacid)：分子式为H3B03，纯度为分析纯；

r）蔗糖（sucrose)：分子式为C12H22011，纯度为分析纯；