GB/T 19567.2-2004 苏云金芽胞杆菌悬浮剂

ICS＿65.100.10一二

G25

中华人民共和国国家标准

GB/T19567.2-2004

苏云金芽胞杆菌悬浮剂

Bacillusthuringgiensissuspensionconcentrate

2004-06-22发布2004-12-01实施

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GB/T19567.2-2004

前Fa

苏云金芽胞杆菌B（acillusthuringiensis,B.t.）是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要

杀虫成分是伴胞晶体中的毒素蛋白，其中，本标准所检测的对鳞翅目害虫有毒力的毒素蛋白的相对分子

量为130kDa。生物测定中甜菜夜蛾用于检测对鳞翅目贪夜蛾属害虫有特性的苏云金芽胞杆菌悬浮剂

的毒力，小菜蛾和棉铃虫用于检测对其他鳞翅目害虫有活性的苏云金芽胞杆菌悬浮剂的毒力。

本标准是根据我国以往制定的苏云金芽胞杆菌行业和企业标准等有关材料，结合我国的实际情况

制定的。

本标准对苏云金芽胞杆菌悬浮剂的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从

而为苏云金芽胞杆菌生产提供了统一的技术依据。

本标准的附录A是资料性附录，附录B是规范性附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准起草单位：农业部农药检定所、华中农业大学微生物农药国家工程研究中心、湖北省生物农

药工程研究中心。

本标准主要起草人：姜辉、喻子牛、陈守文、王开梅、王晓军、吴新平、顾宝根。

本标准由农业部农药检定所负责解释。

GB/T19567.2-2004

苏云金芽胞杆菌悬浮剂

1范围

本标准规定了苏云金芽胞杆菌悬浮剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运。

本标准适用于由用于防治鳞翅目害虫的苏云金芽胞杆菌原粉和助剂制成的苏云金芽胞杆菌悬

浮剂。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有

的修改单不（包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T1250极限数值的表示方法和判定方法

GB/T1600-2001农药水分测定方法

GB/T1601农药pH值的测定方法

GB/T1604商品农药验收规则

GB/T1605-2001商品农药采样方法

GB3796农药包装通则

GB/T16150-1995农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法

GB/T5451-2001农药可湿性粉剂润湿性测定方法

3要求

3.1外观：棕黄色或褐色悬浮液体。

3.2苏云金芽胞杆菌悬浮剂应符合表1要求。

表1苏云金芽胞杆菌悬浮荆控制项目指标

匕一一

4试验方法

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液。

4.1抽样

按照GB/T1605-2001中“液体制剂采样”进行，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量不

少于250mLo

GB/T19567.2-2004

4.2毒素蛋白含f

用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺S（DS)凝胶图像处理法进行测定。

4.2.1方法提要

用碱性溶液处理苏云金芽胞杆菌悬浮剂伴胞晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS，依

蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，用电泳图像扫描蛋白区带面积，进行定量。

4.2.2仪器、设备

a)电泳仪；

b)双垂直式电泳槽(l.5mm凹形带槽橡胶模框），凝胶板面积170mmX170mm(1.5mm,20孔

样品槽模具）；

c)电泳凝胶成像系统；

d）离心机：10000r/min;

e)分析天平：精确至0.0001g,

4.2.3试剂和溶液

4.2.3.1过硫酸钱(APS)。

4.2.3.2十二烷基硫酸钠S（DS)。

4.2.3.3四甲基乙二胺T（EMED).

4.2.3.4氢氧化钠。

4.2.3.530％丙烯酞胺凝胶母液：称取丙烯酞胺30g，亚甲基双丙烯酞胺原（称：甲叉双丙烯酞胺）

0.8g,溶于100mL蒸馏水中，过滤，于4℃暗处贮存备用。

4.2.3.6分离胶缓冲液：称取三轻基甲基氨基甲烷T（ris)18.17g和SDS0.4g溶于蒸馏水中，用浓盐

酸调至pH8.8，用蒸馏水定容至100mL.

4.2.3.7浓缩胶缓冲液：称取Tris6.06g和SDS0.4g溶于蒸馏水中，用浓盐酸调至pH6.8，用蒸馏

水定容至100mL,

4.2.3.8电极缓冲液：称取Tris3.036g，甘氨酸14.42g,SDS1g，用水溶解并定容至1000mL,

4.2.3.93X样品稀释液：1mol/L,pH6.8Tris-HCI18.75mL,SDS6g，甘油30mL,琉基乙醇

15mL，少许澳酚蓝，用蒸馏水定容至100mL,

4.2.3.10固定液：量取95％乙醇500mL，冰乙酸160mL，用蒸馏水定容至1000mLo

4.2.3.11染色液：称取考马斯亮蓝C（BB)R-2501g，加人95％乙醇250mL，冰乙酸80mL,蒸馏水定

容至1000mL,溶解过滤后使用。

4.2.3.12脱色液：量取95％乙醇250mL，冰乙酸80mL，用蒸馏水定容至1000mL,

4.2.3.13毒素蛋白标样：毒素蛋白相（对分子量为130kDa)含量为8.0肠的原粉。

4.2.4样品处理

将试样摇匀后取100p.L加人一1.5rnL离心管，加人0.5mol/L氢氧化钠溶液25IL使（氢氧化

钠溶液的终浓度为0.1mol/L)，放置5min；称取标样20.0mg准（确到0.1mg)，移至1.5mL离心管

中，加1mL水充分悬浮，取100jL加入另一1.5mL离心管，加人0.5mol/L氢氧化钠溶液25t.L使（

氢氧化钠溶液的终浓度为0.1mot/L)，放置约5min。分别向上述标样和试样中加入3X样品稀释液

75j.L，使最终体积为200LtL，于100℃沸水中煮沸6min，离心2（000r/min)10min后取上层清液，以

备电泳上样。

4.2.5SDS分离毒紊蛋白

4.2.5.1制备7.5%聚丙烯酸胶凝胶

采用不连续缓冲系统，制胶方法见附录A资（料性附录）。

4.2.5.2上样

取上述标样溶解液上层清液，于聚丙烯酞胺凝胶的上样孔中分别上样6,8,10,12,14f.L毒（素蛋白

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含量约为3ug-~.-7fig)，作为标准曲线；再取一定体积的试样溶液上层清液毒（素蛋白含量约为5tog)，加

人到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。

4.2.5.3电泳

电泳初期电压控制在100V左右，待试样进入分离胶后，加大电压到170V，继续电泳，当指示剂前

沿到达距底端1cm左右时停止电泳，取出胶板，在7.5%体（积分数）乙酸中浸泡30mine

4.2.5.4染色

将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝C（BB)R-250染色液染色过夜。

4.2.5.5脱色

倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加人脱色液，于37℃恒温脱色，更换几次脱色液，至背景清

晰为止。

4.2.6测定

胶板经脱色后，可清晰地看到分子量为130kDa蛋白区带，用凝胶成像系统对凝胶进行分析。

样品中毒素蛋白的百分含量X（）按式（1)进行计算。

X＿M二、、、100％．．．．………‘…．．‘．．．．．．．．．．……（1)

cxV”－·、－一了＿

式中：

M一一－由标准蛋白回归曲线计算得到的蛋白量；

—‘样品的浓度；

V—样品的加样体积；

n—样品的稀释倍数。

4.2.7允许差

取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于5％.

4.3毒力效价的测定

按附录B规（范性附录）进行。

4.4pH值的测定

按GB/T1601测定。

4.5细度的测定

按