DB22/T 3074-2019 呼吸道常见病原菌检测-微流控芯片法

ICS11

C05

DB22

吉林省地方标准

DB22/T3074—2019

呼吸道常见病原菌检测-微流控芯片法

Microfluidicchipmethodfordetectingcommonpathogensofrespiratorytract

2019-12-25发布2020-02-01实施

吉林省市场监督管理厅发布

DB22/T3074—2019

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。

本标准由吉林省卫生健康委员会提出并归口。

本标准起草单位：吉林大学。

本标准主要起草人：姜艳芳、张鹏、刘思文、刘勇、邹红雁、司睿、李婷婷。

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DB22/T3074—2019

呼吸道常见病原菌检测-微流控芯片法

1范围

本标准规定了呼吸道常见病原菌微流控芯片检测的原理、生物安全要求、材料与试剂、样本、检测、

数据处理、质量控制、结果判定与表述、检测报告、废弃物处理与防止污染的措施。

本标准适用于呼吸道肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假

单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌的微流控芯片检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1微流控芯片Microfluidicchip

检测样本在一个小的实验装置中连续完成样本核酸提取、纯化、扩增等过程，该装置也被称为芯片

实验室（LabonaChip）。芯片上包含各种微管道、微腔室等，尺寸通常在微米级，所操作的流体通

常在微升或纳升级，具有样本及试剂消耗少的特点。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution）。

LAMP：环介导恒温扩增法（LoopmediatedIsothermalAmplification）。

Spn：肺炎链球菌（StreptococcusPneumoniae）。

Sau：金黄色葡萄球菌（StaphylococcusAureus）。

Mrs：耐甲氧西林葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus）。

Kpn：肺炎克雷伯菌（KlebsiellaPneumoniae）。

Pae：铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）。

Aba：鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）。

Sma：嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）。

Hin：流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）。

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5原理

基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸

时，另一条链就会解离，变成单链。针对靶序列的6个区域设计4条特异引物（包括2条内引物和2

条外引物），利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA，其反应过程包括哑铃状

模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段

混合物。通常为了提高反应效率，还在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链

置换合成，循环复制。

在微流控芯片上，利用荧光染料掺入法在恒温扩增微流控芯片核酸分析仪上进行恒温（65℃）反

应和实时荧光分析，在具有链置换功能的聚合酶作用下，扩增阳性的样品会产生类似“S”形扩增曲线

一步完成对靶基因的扩增和检测。

6生物安全要求

采样及检测过程所涉及的实验操作应按GB19489规定执行。

7材料与试剂

7.1仪器与耗材

7.1.1II级生物安全柜。

7.1.2涡旋混合仪。

7.1.3金属浴或水浴锅。

7.1.4高压灭菌器。

7.1.5微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。

7.1.6微量带滤芯吸头：10μL、100μL、200μL、1000μL。

7.1.7医用冰箱：2℃～8℃、-20℃、-80℃。

7.1.8低温高速离心机，最高离心力达15000r/min以上。

7.1.9低速离心机，最高离心力达1000r/min以上。

7.1.10恒温扩增微流控芯片核酸分析仪。

7.1.11核酸快速提取仪。

7.1.12芯片封口膜。

7.1.13微流控芯片。

7.1.14离心管：200μL、1.5mL、15mL。

7.2试剂

7.2.1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682规定的二级水，所用化学试剂均为

分析纯。

7.2.210%氢氧化钠溶液。

7.2.3核酸提取试剂（等效商品化试剂）。

7.2.4恒温扩增试剂（等效商品化试剂）。

8样本

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DB22/T3074—2019

8.1采集

8.1.1清晨采集患者漱口后从肺深处咳出的痰液1mL～2mL。

8.1.2样本接收记录表参见附录A。

8.2保存和运输

8.2.1待检样本在室温（15℃～30℃）下最多可以保存3d，在4℃下可保存4d～10d，-20℃

保存不超过3个月，-80℃以下长期保存。

8.2.2应置于低温、密闭的无菌容器内运输。

8.3接收和拒收

检测实验室应制定样本接收要求，可拒绝接收以下样本：

a)样本量不满足8.1.1要求或含血量过高；

b)没有按照