GB/T 26436-2010 禽白血病诊断技术

ICS11．220

B41

园亘

中华人民共和国国家标准

1

26436—200

GB／T

禽白血病诊断技术

foravianleukosis

techniques

Diagnostic

2011-01-14发布201

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局学寿

中国国家标准化管理委员会况111

26436—2010

GB／T

前言

本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录，附录G、附录H为资料性

附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

181)归口。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SC／TC

本标准起草单位：山东农业大学、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、华南农业大学。

本标准主要起草人：崔治中、孙淑红、赵鹏、杨素、沙才华、廖明、曹伟胜。

26436--2010

GB／T

引言

leukosis

禽白血病病毒(avian

织的良性和恶性肿瘤，是鸡群中除马立克氏病病毒(MDV)和禽网状内皮增生症病毒(REV)外的又一

类重要的致肿瘤病毒。

禽白血病是一类由ALV相关的反转录病毒引起鸡的不同组织良性和恶性肿瘤病的总称。随发生

肿瘤的主要细胞成分不同，分别称之为不同名称的肿瘤。ALv可分为A～J10个亚群，其中仅A亚

群、B亚群、c亚群、D亚群、E亚群、J亚群病毒与鸡相关。A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、J亚群属外

源性ALV，与禽白血病的不同类型肿瘤发病相关。E亚群病毒基因组可完整地整合进感染鸡的染色体

基因组并稳定地遗传下去，也可从中再复制出传染性病毒颗粒，因而称之为内源性病毒。此外，在一些

鸡的染色体的不同部位，还可能带有一些ALV的基因组片段。E亚群ALv的致病性很低或没有致病

性，不属于净化对象，但很多鸡群中包括一些无特定病原(SPF)鸡群都可能带有E亚群内源性ALv，它

的感染不会给鸡群带来不良影响，但会干扰检测。

目前，该病对我国养鸡业的危害很大。在国际种禽贸易中，外源性白血病病毒感染是最主要的检测

对象之一。

Ⅱ

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GB／T

禽白血病诊断技术

1范围

本标准规定了病料中ALV特异血清抗体和外源性ALV的检测方法。

本标准适用于判断鸡群或病料中是否有外源性ALV感染。

2临床症状和病理变化

ALv主要引起感染鸡在性成熟前后发生肿瘤死亡，感染率和发病死亡率高低不等，死亡率最高可

达20％。一些鸡感染后虽不发生肿瘤，但可造成产蛋性能下降甚至免疫抑制。

淋巴样白血病是最为常见的经典型白血病肿瘤，肿瘤可见于肝、脾、法氏囊、肾、肺、性腺、心、骨髓等

器官组织，肿瘤可表现为较大的结节状(块状或米粒状)，或弥漫性分布细小结节。肿瘤结节的大小和数

量差异很大，表面平滑，切开后呈灰白色至奶酪色，但很少有坏死区。在成红细胞性白血病、成髓性细胞

白血病、髓细胞白血病中，多使肝、脾、肾呈弥漫性增大。J亚群ALV感染主要诱发髓细胞样肿瘤，它最

常见的特征性变化主要为肝脾肿大或布满无数的针尖、针头大小的白色增生性肿瘤结节。在一些病例

中，还可能在胸骨和肋骨表面出现肿瘤结节。

单纯苏木精伊红染色(H．E染色)的病理组织切片观察在诊断上有一定参考意义。在表现为淋巴

区别；在表现为髓样细胞瘤时，既要与REV诱发的类似肿瘤细胞相区别，也要与嗜中性白细胞浸润性

炎症相区别，如鸡戊型肝炎病毒感染引起的肝局部炎症。最终的鉴别诊断以肿瘤组织中的病毒抗原检

测或病毒分离鉴定为最可靠依据。

3病毒的分离培养、检测和鉴定

3．1试剂和仪器

3．1．1试剂

mol／L

DMEM液体培养基(pH7．2)、0．25％胰酶、磷酸盐缓冲液(o．01PBS，pH7．2)、抽提缓冲液、

析纯)、75％酒精、碘酒、细胞生长液(含有5％胎牛血清或小牛血清的DMEM液体培养基)、细胞维持液

DNA

Marker、TAE电泳缓冲液、氯化钙(o．1

分析纯)。

3．1．2仪器

000

锥形瓶、荧光显微镜、恒温培养箱，冰冻台式离心机(≥12r／min)、一20℃冰箱、一80℃冰箱、

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GB／T

培养板、SPF隔离器、紫外光凝胶成像分析仪、微量移液器、低温恒温水槽(16℃)、吸水纸。

3．2分离病毒用细胞

3．2．1鸡胚成纤维细胞(CEF)

鸡胚成纤维细胞制备方法见附录A。

3．2．2鸡胚成纤维细胞自发永生株(DFl)细胞

DFl细胞培养基制备方法见附录B。

3．3病料的采集与处理

3．3．1全血、血清或血浆

取疑似病鸡的全血、带有白血细胞的血浆或血清，无菌接种于长成单层的CEF或DFl，置于含5％

二氧化碳的37℃恒温培养箱中培养。

3．3．2脏器

采集疑似病鸡的脾脏、肝脏、肾脏，按脏器质量的1倍～2倍加入灭菌生理盐水(含青霉素和链霉素

000000

各1Iu／mL)研磨，直至成匀浆液。将悬液移至离心管中充分摇振后，4℃，10r／rnin离心

5min，收集上清液。按3．4．1．1中的方法接种培养或一70℃保存备用。

3．3．3疫苗样品

疫苗样品处理后接种CEF培养扩增病毒。但为了鉴别是否是外源性ALV，应接种DFl细胞或其

他抗E亚群自血病鸡细胞(C／E)鸡来源的细胞。

3．3．4咽喉、泄殖腔棉拭子

取咽喉棉拭子时，将棉拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3次～5次取咽喉分泌液；取泄殖腔棉拭子

时，将棉拭子深入泄殖腔转3圈并沾取少量粪便；将棉拭子头一并放人盛有1．5mL磷酸盐缓冲液的无

000000

菌离心管中(含青霉素和链霉素各1Iu／mL)，盖上管盖并编号，10r／rain离心5

rain后取上清

备用。

3．4病毒的分离培养与鉴定

3．4．1病毒的分离培养

3．4．1．1接种培养：病料接种细胞单层后，置于37℃培养箱中培养2

h。然后吸去细胞生长液，换入细

d～7

胞维持液，继续培养5d。

d～7d。

3．4．1．2细胞传代：将3．4．1_1培养的细胞传代于加有盖玻片的平皿中，培养5

3．4．2病毒的鉴定

3．4．2．1间接免疫荧光抗体反应(IFA)

3．4．2．1．1固定

将盖玻片上的单层细胞，在自然干燥后滴加丙酮一乙醇(6：4)混合液室温固定5

min，待其自然干

2

GB／T

燥，用于IFA，或置于--20℃保存备用。设未感染的细胞单层为阴性对照。

3．4．2．1．2加第一抗体

用0．01

40rain，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次。

3．4．2．1．3加FITC标记二抗

40rain，用磷酸盐缓冲液洗涤3次。

3．4．2．1．4加甘油

滴加少量50％甘油磷酸盐缓冲液于载玻片上，将盖玻片上的样品倒扣其上。在荧光显微镜下

观察。

3．4．2．1．5结果观察与判定

被感染的CEF细胞内呈现亮绿色荧光，周围未被感染的细胞不被着色或颜色很淡。在放大200×～

400×时，可见被感染细胞胞浆着色，判为ALV阳性，无亮绿色荧光者判为阴性。

3．4．2．2ALV—p27抗原ELISA检测

3．4．2．2．1抗原样本制备

d～14

将病料同3．4．1．1和3．4．1-2所述方法接种细胞，培养7d后取上清液直接检测；也可取细

胞培养物冻融后检测；或用从泄殖腔采集的棉拭子。

3．4．2．2．2

p27抗原ELISA检测

ALV—p27抗原可用商品试剂盒检测，对不同来源的样品，按厂家的说明书操作。当样本在DFl细

腔棉拭子样品检测出p27，说明有ALV，但不能严格区分外源性或内源性。

3．5ALV亚群鉴定

ALV亚群如A亚群、B亚群、C亚群、D亚群。

的gp85基因序列做同源性比较，即可对病毒进行分群。ALV病毒分群方法见附录D。

3．6荧光定量PCR扩增ALV-J

该方法适用于鸡群的检疫或ALv-J感染的净化，可在较短时间内完成大量样品的特异性检测。血

浆或泄殖腔棉拭子样品可直接用于检测，见附录E。

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4血清特异性抗体的检测

4．1仪器和试剂

甘油。

4．1．2仪器：酶标仪、荧光显微镜、37℃恒温培养箱。

4．2样品的采集

样品的采集见3．3。

4．3抗体的检测

4．3．1ELISA检测

可选用禽白血病A亚群、B亚群及J亚群抗体ELISA检测试剂盒，严格按商品提供的说明书操作

和判定。

4．3．2IFA检测

4．3．2．1抗原

抗原制备方法见附录F。

4．3．2．2操作步骤

在相应的盖玻片上或抗原孔中加入用磷酸盐缓冲液(1：50)稀释的待检鸡血清，在37℃下作用

40

37℃作用40min，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加少量50％甘油磷酸盐缓冲液后在荧光显微镜下观察。

4．3．2．3结果的判定

抗体阳性的鸡，就表明该群体曾经有过外源性ALv感染。

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附录A

(规范性附录)

O系SPF鸡胚成纤维细胞(cEF)的制备

选择9日龄～10日龄发育良好的SPF鸡胚。先用碘酒棉再用酒精棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出

鸡胚，去头、四肢和内脏，放人灭