DB5304/T 060-2023 主要动物疫病免疫抗体监测技术规范

ICS11.220

CCSB41

5304

玉溪市地方标准

DB5304/T060—2023

主要动物疫病免疫抗体监测技术规范

2023-04-20发布2023-07-19实施

玉溪市市场监督管理局发布

DB5304/T060—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由玉溪市动物疫病预防控制中心提出。

本文件由玉溪市农业农村局归口。

本文件的附录A、B、C、D、E为资料性附录。

本文件起草单位：玉溪市动物疫病预防控制中心

本文件主要起草人：吕嵘、杨耀兰、罗晓燕、杨秋楠、宋诗雅、李晶、张晓舟、徐聪、荚洪涛、吴

明伟、杨曦。

I

DB5304/T060—2023

主要动物疫病免疫抗体监测技术规范

1范围

本文件规定了动物疫病免疫抗体监测的主要监测病种、血清样品采集、采样单填写、血清分离与保

存、样品的送检与接收、抗体监测方法及结果判定、监测结果记录与汇总、血清留样、无害化处理等。

本文件适用于玉溪市主要动物疫病免疫抗体监测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T18090猪繁殖与呼吸综合征诊断方法

GB/T18935口蹄疫诊断技术

GB/T27982小反刍兽疫诊断技术

GB/T35906猪瘟抗体间接ELISA检测方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

动物疫病

主要是指生物性病原引起的动物群发性疾病，包括动物传染病、寄生虫病。

3.2

抗体

在病原刺激下产生的一类能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，抗体主要存在于体液中。

3.3

免疫监测

普检或抽检动物群体的抗体水平，以监控群体的免疫状态，为实施计划免疫和增强免疫提供依据。

3.4

血清

血浆去除纤维蛋白原后的(胶体性)液体。

4主要监测病种

1

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在玉溪市范围内开展的主要动物疫病监测病种。

——国家强制免疫病种：高致病性禽流感、口蹄疫、小反刍兽疫。

——地方计划免疫病种：新城疫、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征。

5血清样品采集

5.1采血器材

防护服、防护口罩、无粉乳胶手套、注射器、针头、普通真空采血管、2ml离心管、碘酊、75%酒精

棉球、冰袋、冷藏容器、采样登记表、记号笔、签字笔等。

5.2采血时间

猪免疫注射28天后（口蹄疫免疫35天后），其他动物免疫21天后方可采血。

5.3采血方法

对采血部位的皮肤先剃（拔）毛，碘酊消毒，75%的酒精脱碘。生猪采用站立式或仰卧式前腔静脉

采血、牛羊站立式颈静脉或尾静脉采血、禽类翅静脉采血。

6采样单填写

采血时应按《血清样品采样登记表》（参见附录A）的内容详细填写采样单，采样单一式两份，一

份由被采样单位保存，一份由采样单位保存。

7血清的分离与保存

7.1血清分离

采集的血液样品可室温放置析出血清，或经4000r/min、3-5分钟离心，吸出上层血清，放置于合适

的离心管中。

7.2血清编号

血清编号为“行政区域拼音大写字母”加上“不同动物种类血清编号英文字母和阿拉伯数字组合”

用防水记号笔清晰标记于离心管。

——猪以“A01、A02、A03„„An”模式编写；

——牛以“B01、B02、B03„„Bn”模式编写;

——羊以“C01、C02、C03„„Cn”模式编写；

——禽以“D01、D02、D03„„Dn”模式编写。

例如：红塔区猪血清编号为：HTA01;通海县禽血清编号为：THD01。

7.3血清的保存

血清立即检测放置4℃保存；如果保存时间较长，应放置在-20℃冰箱内保存。

8样品的送检与接收

2

DB5304/T060—2023

运输血清样品时将血清放在盛有冰块的冷藏箱中运送。样品送检前送检单位填写《实验室样品送样

表》（参见附录表B.1）；样品送达兽医实验室，实验室人员进行接收样品登记，填写《实验室接样登

记表》（参见附录表B.2）。

9抗体监测方法及结果判定

9.1高致病性禽流感

9.1.1免疫抗体监测方法：

血凝和血凝抑制试验（HA-HI）

9.1.1.11%鸡红细胞制备

分别至少采集三只无特定病原体（SPF）健康公鸡或未免疫（禽流感和新城疫）健康公鸡全血3~5ml，

置于盛有30~40ml灭菌生理盐水离心管中，洗涤离心2次，每次均以2000r/min离心5min，洗涤后弃去

上清，混合于一个离心管中，以2000r/min离心5min。吸取底层红细胞用灭菌生理盐水配置1%体积的

红细胞悬液。

9.1.1.2血凝试验（HA）

a)在96孔V型微量反应板中，每孔加25μL灭菌生理盐水。

b)在微量反应板第1孔加25μL标准阳性抗原，充分混匀。

c)依次从第1孔吸取25μL液体加入第2孔，混匀后吸取25μL加入第3孔，如此对倍稀释至

第11孔，从第11孔吸取25μL弃去。

d)第12孔加入25μL灭菌生理盐水为对照孔。

e)每孔再分别加25μL灭菌生理盐水和25μL1%鸡红细胞悬液。震荡混匀，室温（20℃~25℃）

静置30min，对照孔红细胞呈纽扣状沉入板底，进行结果判定。

f)结果判定：将反应板倾斜60°，观察红细胞有无泪珠状流淌，完全无泪珠样流淌（100%凝集）

的最高稀释倍数判为血凝效价。

9.1.1.3血凝抑制试验（HI）

9.1.1.3.14个血凝单位病毒抗原的配置

根据HA试验测定的效价配制4个血凝单位（即4HAU）的病毒抗原。例：以血凝试验血凝效价（凝集

终点）为10log2或210（1：1024）为例，4HAU为1024/4=256（1：256），在255份生理盐水里加入1份抗

原。

9.1.1.3.2抗原回测检查

血凝抑制试验前应对4HAU抗原进行回测，调整准确。选取96孔V型板5个孔，在2~5孔每孔加入25μ

L灭菌生理盐水，将配制好的4HAU抗原25μL加入第1~2孔，从第2孔开始按1：1、1：2、1：4、1：8、1：

16倍比稀释，即依次形成4HAU、2HAU、1HAU、1/2HAU、1/4HAU抗原浓度；再分别加入灭菌生理盐水25

μL和1%鸡红细胞悬液25μL。震荡混匀，室温（20℃~25℃）静置30min，观察结果。若配置的4HAU抗

原液准确,则1：4稀释度将出现凝集终点；如高于4HAU,凝集终点将后移，在已配制好的4HAU抗原液中添

加等量的灭菌生理盐水，二次回测；如低于4HAU,凝集终点将前移，在已配制好的4HAU病毒抗原液中添

加等量的抗原，二次回测。

3

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9.1.1.3.3血清抗体效价测定

a)在微量反应板的第1孔~第11孔加入25μL灭菌生理盐水，第12孔加入50μL灭菌生理盐水

作为空白对照。

b)吸取25μL血清加入第1孔内，充分混匀后，吸取25μL加入到第2孔，依次对倍稀释至第

10孔，从第10孔吸取25μL弃去。第11孔为抗原对照。

c)1孔~11孔均加入25μL4HAU抗原，在室温（20℃~25℃）静置30min。

d)每孔加入25μL1%鸡红细胞悬液，震荡混匀，室温（20℃~25℃）静置30min，待对照孔（12

孔）红细胞呈纽扣状沉入孔底时判定结果。

e)当抗原对照孔（第11孔）完全凝集，且阴性对照血清抗体效价不高于2log2或22（1：4），

阳性对照血清抗体效价与已知效价误差不超过1个滴度时，试验方可成立。以完全抑制4HAU

病毒抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI抗体效价。

9.1.2结果判定

血清HI抗体效价≤3log2或23判为HI试验阴性；HI效价≥4log2或24判为HI试验阳性。

9.2口蹄疫

9.2.1免疫抗体监测方法

酶联免疫吸附试验（ELISA）

9.2.1.1液相阻断ELISA

液相阻断ELISA试验方法按照GB/T18935执行；

9.2.1.2竞争ELISA

采用商品试剂盒进行检测，按其说明书进行操作。

9.2.2结果判定

——液相阻断ELISA：按照GB/T18935执行；

——商品化ELISA试剂盒按其说明书进行判定。

9.3小反刍兽疫

9.3.1免疫抗体监测方法

竞争ELISA试验方法按照GB/T27982执行；采用商品化ELISA试剂盒进行检测，按其说明书进行操作。

9.3.2结果判定

——竞争ELISA：按照GB/T27982执行；

——商品化ELISA试剂盒按其说明书进行判定。

9.4新城疫

9.4.1免疫抗体监测方法

血凝和血凝抑制试验（HA-HI），具体试验步骤同9.1.1。

4

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9.4.2结果判定

血清HI抗体效价≤3log2或23判为HI试验阴性；HI效价≥4log2或24判为HI试验阳性。

9.5猪瘟

9.5.1免疫抗体监测方法

9.5.1.1间接ELISA

间接ELISA检测方法按照GB/T35906执行；

9.5.1.2竞争ELISA

采用商品化ELISA试剂盒进行检测，按其说明书进行操作。

9.5.2结果判定

——间接ELISA：按照GB/T35906执行；

——商品化ELISA试剂盒按其说明书进行判定。

9.6猪繁殖呼吸综合征

9.6.1免疫抗体监测方法

间接ELISA试验方法按照GB/T18090执行；采用商品化ELISA试剂盒进行检测，按其说明书进行操作。

9.6.2结果判定

——间接ELISA：按照GB/T18090执行；

——商品化ELISA试剂盒按其说明书进行判定。

10监测结果记录与汇总

10.1监测结果记录

实验室完成血清抗体检测后，按要求填写试验结果记录表。血凝抑制试验填写《血凝抑制试验结果

记录表》（参见附录表C.1）；ELISA试验填写《ELISA试验结果记录表》（参见附录表C.2）。

10.2监测结果汇总

以监测县（市区）、乡镇（街道）、规模畜禽场、行政村为单位，分动物病种、动物种类等进行结

果汇总，填写《血清学监测结果统计表》（参见附表C.3）。

11血清留样

血清检测完毕后，需要对血清样品进行保存不少于15天。样品留存填写《血清留样记录表》，(参

见附录D)。

12无害化处理

5

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实验完毕后，及时分类收集实验室废弃物。具有感染性实验室废弃物应进行高压蒸汽灭菌或放入消

毒剂中浸泡24小时，移交专业医疗废弃物或无害化处理机构处置。无害化处理填写《实验室废弃物处理

记录表》，（参见附录E）。

6

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A

A

附录A

（资料性）

实验室血清样品采样表

表A.1血清样品采样登记表（散养户）

样品所在县

疫苗生产

样品编号（市区）、乡畜主姓名动物种类年龄免疫时间疫苗类型畜主签字备注

厂家

镇、村