GB/T 34331-2017 黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜检测方法

ICS71.040.40

G04(3B

中华人民共和国国家标准

GB/T34331—2017

黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜

检测方法

TestmethodofCucumbergreenmottlemosaicvirus

bytransmissionelectronmicroscopy

2017-10-14发布2018-09-01实施

发布

GB/T34331—2017

目次

冃URI

引言n

i范围i

2规范性引用文件1

3术语和定义1

4仪器设备、试剂和材料、环境条件1

5试样2

6透射电子显微镜检测步骤4

7血清学和分子生物学验证4

8检测结果发布4

9除害处理5

附录A（资料性附录）黄瓜绿斑驳花叶病毒相关资料6

附录E（资料性附录）常用试剂的配方8

附录C（资料性附录）黄瓜绿斑驳花叶病毒电镜照片11

GB/T34331—2017

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本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由全国微束分析标准化技术委员会(SAC/TC38)提出并归口。

本标准起草单位:浙江大学、浙江省植物保护检疫局、浙江省农业科学院。

本标准主要起草人:洪健、黎军英、吴建祥、周雪平、王荣洲、谢礼、宋西娇。

I

GB/T34331—2017

引言

黄瓜绿斑驳花叶病毒｛Cucumber^reenmottle""丿sa，c,CGMMV）是侵染西瓜、黄瓜、舌ft瓜、葫

芦等葫芦科作物的重要检疫性病毒病原,被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。该

病毒侵染西瓜引起的褪绿斑驳病，给西瓜产业造成严重威胁。典型的CGMMV为直径18nm,长度

300nm的刚直杆状粒子，在病毒分类学上归属于植物杆状病毒科｛Vir^aviridae^烟草花叶病毒属

CTobafnovirus）（附录A）。应用透射电子显微镜可观察其形态结构以及在细胞内的分布特征，是辅助

于血清学检测和分子生物学检测的重要形态学诊断依据。为了正确指导黄瓜绿斑驳花叶病毒形态学检

测诊断工作，有必要制定该病毒的透射电子显微镜检测方法国家标准。

n

GB/T34331—2017

黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜

检测方法

1范围

本标准规定了应用透射电子显微镜对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行形态学检测的技术要求和规范。

本标准适用于黄瓜绿斑驳花叶病毒的检验检疫与鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T28071-2011黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法

SN/T2122-2015进出境植物及植物产品检疫抽样方法

SN/T296—2011植物病毒检测规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

病毒virus

一种由核酸和蛋白质外壳组成，具有侵染活性并能够自我复制的细胞内寄生病原生物。

3.2

病毒粒子virion

复制、装配完善的成熟病毒颗粒。

3.3

负染色negativestain

利用高密度的重金属盐染色液（如磷鹄酸、醋酸铀等）染色后，将微小的试样颗粒包围起来，在暗背

景下显示试样的形态及微细结构。

3.

超薄切片ultrathinsection

应用超薄切片机将树脂包埋的生物试样切成厚度为50nm~100nm的薄片，经电子染色后用于透

射电镜观察。

3.5

免疫电子显微术immunoelectronmicroscopy

利用抗原抗体特异性结合的原理，以抗体捕获抗原或胶体金标记的抗体为探针在透射电镜或扫描

电镜超微结构水平上定位、定性及半定量显示抗原的技术方法。

4仪器设备、试剂和材料、环境条件

4.1仪器设备

4.1.1透射电子显微镜。

GB/T34331—2017

4.1.2超薄切片机。

4.1.3玻璃制刀机。

4.1.超薄切片钻石刀。

4.1.5高速离心机。

4.1.6正置光学显微镜。

4.1.7研钵。

4.1.8微型研磨器。

4.1.9涡旋振荡仪。

4.2试剂和材料

4.2.1戊二醛（分析纯）。

4.2.2四氧化娥（结晶体）。

4.2.3丙酮（分析纯）。

4.2.乙醇（分析纯）。

4.2.5环氧树脂包埋剂。

4.2.6醋酸铀（分析纯）。

4.2.7柠檬酸铅（分析纯）。

4.2.8磷鹄酸（分析纯）。

4.2.9亚甲基蓝。

4.2.10CGMMV多抗血清。

4.2.11PCR检测离心管（0.5mL.1.5mL）0

4.2.12Parafilm膜。

4.2.13包埋管。

4.2.1硅胶包埋板。

4.2.15覆Formvar膜的电镜铜网。

4.3环境条件

超薄切片机、透射电镜应安装在独立的房间，T作环境应符合以下要求。

超薄切片机:相对湿度小于60%,温度（20±5）°C,电源电压稳定（220+22）V,满足防震要求。

透射电镜:相对湿度小于60%,温度（20±5）°C,电源电压稳定（220+22）V,具备仪器专用地线，接

地电阻值参照仪器说明书的要求。

5试样

5.1试样来源

5.1.1西瓜、黄瓜、甜瓜和葫芦等葫芦科植物的种子。

5.1.2田间受CGMMV侵染的葫芦科植物的叶、茎、花、根等新鲜材料。

5.1.3人T接种CGMMV的鉴别寄主和繁殖寄主植物。

5.2取样要求

5.2.1进出境植物检疫的取样按照SN/T2122-2015的规定执行。

5.2.2田间作物取样及试样处理按照SN/T2964-2011的规定执行。

2

GB/T34331—2017

5.3试样预处理

5.3.1组织粗汁液试样：将呈现明显斑驳花叶症状的植物组织1g与1mL0.05mol/L磷酸缓冲液

（pH值7.0）混合，在研钵或微型研磨器中研磨,过滤或离心后获得粗汁液。种子剥皮去仁后，将种皮于

液氮中研磨制备组织粗汁液，也可以在适当温度和光照条件下使其发芽后再制备获取组织粗汁液。磷

酸缓冲液的配制参见附录B。

5.3.2提纯病毒试样:将分离提纯的CGMMV用双蒸憾水或0.01mol/L的磷酸缓冲液（pH值7.0）稀

释至适合电镜清晰观察的浓度。

5.3.3超薄切片试样:采集呈现明显斑驳花叶症状的感病植物叶片，取病叶的退绿黄化边缘部位供超

薄切片前处理之用。

5.电镜试样制备

5.4.1负染色技术

5.4.1.1悬滴法：以银子夹持铜网，用移液器吸一滴病毒试样悬液滴在覆膜的铜网上，然后用滤纸片从

铜网边缘吸掉多余液体,待液体干燥前，采用2%（wAO磷磚酸负染色液（pH值6.8）进行负染色，染色

时间1min〜2min,干燥后待检。负染色液的配制参见附录B。

5.4.1.2漂浮法:在培养皿内铺上Parafilm膜,用移液器吸一滴病毒试样悬液滴在Parafilm膜上；将铜

网膜面朝下放置于病毒试样悬液滴上静置1min〜2min,然后夹起铜网，用滤纸片从铜网边缘吸除多

余液体，再将铜网膜面朝下放置于在2%（w/v）磷鹄酸负染色液滴（pH值6.8）±进行负染色，染色时间

1min〜2min,干燥后待检。

5.4.2免疫电子显微术（免疫吸附法）

5.4.2.1在培养皿内铺上Parafilm膜，用移液器吸一滴1:10〜1:100倍稀释的CGMMV多抗血清滴

在Parafilm膜上;将铜网膜面朝下放置于多抗血清液滴上，在培养皿中保湿15mino

5.4.2.2用20滴0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH值7.0）连续滴洗铜网，洗除多余抗血清。

5.4.2.3用滤纸片吸掉余液后，将铜网膜面朝下放置于病毒试样悬液滴上,在培养皿中保湿反应30min

（如种子的病毒含量低，反应时间可延长至数小时或过夜）。

5.4.2.4反应结束后用20滴0.05mol/L的磷酸缓冲液、30滴双蒸憾水先后连续滴洗试样铜网。

5.4.2.5用滤纸片