DB45/T 1856-2018 蛤蚧及其伪品COI条形码鉴别技术规程

ICS65.020.30

B3838B

DB45

广西壮族自治区地方标准

DB1856—201845/T

蛤蚧及其伪品COI条形码鉴别技术规程

IdentificationofofIdentificationgeckoGekkoAdultandLinnaeusCOItheUsingerants

BarcodeBarcode

2018-10-20发布2018-11-20实施

广西壮族自治区质量技术监督局发布

DB45/T1856DB45/T—2018

目目次

前言................................................................................II................................................................................前言

11..............................................................................范围

21........................................................................术语和定义

32..........................................................................鉴别程序

附录A（规范性附录）蛤蚧伪品3........................................................

附录B（规范性附录）蛤蚧及其伪品DNACOI序列4........................................

I

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前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准按照GB/T

本标准由广西壮族自治区卫生和计划生育委员会提出。

本标准由广西卫生标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：广西壮族自治区药用植物园。

本标准主要起草人：徐永莉、李力、闫志刚、张月云、赵成坚、黄勇、谷颖乐。

III

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蛤蚧及其伪品COI条形码鉴别技术规程

11范围

Gekkogecko本标准规定了蛤蚧（Gekko）及其伪品的COI条形码鉴别的术语和定义、鉴别程序。

本标准适用于广西境内蛤蚧及其伪品COI条形码的鉴别。本标准适用于广西境内蛤蚧及其伪品COI条形码的鉴别。

22术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.12.1

GekkogeckoGekko蛤蚧

GekkogeckoGekko蛤蚧（）属爬行纲Reptilia、有鳞目Squamata、壁虎科Gekkonidae、壁虎属Gekko。蛤

蚧药材为除去内脏的干燥体。包括黑点蛤蚧和红点蛤蚧。

2.22.2

蛤蚧伪品蛤蚧伪品geckoGekkoadulterants

市场上当蛤蚧销售和使用的动物。详见附录A。

2.32.3

DNA条形码DNAbarcodingbarcodingDNADNA条形码

生物体内能够代表该物种的标准的、有足够变异的、易扩增且较短的DNA片段。生物体内能够代表该物种的标准的、有足够变异的、易扩增且较短的DNA片段。

2.42.4

COICOI

细胞色素c氧化酶亚基I(cytochromecoxidasesubunitI，COI)，线粒体基因组的蛋白质编码基subunitoxidasec(cytochrome细胞色素c氧化酶亚基I

因。

2.52.5

COI条形码COIbarcodingbarcodingCOICOI条形码

集中存在于动物线粒体细胞色素C氧化酶亚单位I(COI)特定区段的一段大约有650个碱基的DNA序

列。

2.62.6

近邻相接法neighbor-joiningmethod(NJ法)method(NJ法)neighbor-joining近邻相接法

一种研究DNA而建立亲缘关系的方法，由序列建立支序图或亲缘关系图。

1

DB45/T1856DB45/T—2018

2.72.7

bpbp

碱基对。

33鉴别程序

3.13.1鉴别条件

PCR扩增仪、核酸电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像系统、组织基因提取试剂盒、序列比对软件。

3.23.2引物序列

LCOI490：5'—GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG—3'。

HCO2198：5'—TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA—3'。

3.33.3DNA的提取

取药材样品，75％乙醇表面消毒，用灭菌手术刀，取样品皮下肌肉约30mg,剪碎，DNA提取研磨仪

研磨2min，用组织基因提取试剂盒提取总DNA，提取步骤参见各产品使用说明书。

3.43.4PCR扩增

反应体积为25μL，所加试剂包括5U/μLTaqDNA聚合酶(TaKaRa)0.5μL，10mmol/LdNTP1μL，

10pmol/μL上下游引物各0.5μL，10×buPCRffer2.5μL，Mg2+1.5μL，DNA模板1μL。PCR反应在PCR

扩增仪上进行，反应参数为：95℃3min，(94℃45s，55℃45s，72℃45s）×39，72℃5min，4℃

保存。

3.53.5电泳

将PCR产物5μL与上扬染料3μL混合，加入1.5％琼脂糖凝胶的点样孔中，同时设100bp梯度DNA标准

分子量作为片段大小的标准。100V电压电泳约40min。

3.63.6成像及分析

将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察窗内，观察分析并成像保存。

3.73.7DNA样品测序

凝胶上出现一条600bp大小的特异性条带PCR扩增产物用试剂盒对PCR扩增的样品进行纯化，纯化的

步骤参见各产品使用说明书，将检测纯化后的样品进行测序。

3.83.8鉴别

将所得序列经计算机拼接辅以人工校对，采用Biast序列相似性搜索比对，蛤蚧COI5’端序列，即

蛤蚧DNA条形码序列，562bp的长度用于种间水平的分析。蛤蚧同其伪品间的序列差异为6.0％～64.0％，

平均序列差异为35.0％。通过NJ法并利用实验序列和GenBank序列所构建系统聚类树。基于COI序列构建

的NJ树将蛤蚧与伪品区分。

2

DB45/T1856DB45/T—2018

AA

附附录A

（规范性附录）（规范性附录）

蛤蚧伪品蛤蚧伪品

Gekkoswinhonis无蹼壁虎Gekko、中国瘰螈chinensisParamesotriton、多疣壁虎japonicusGekko、睑

虎Goniurosauruslichtenfelderi、西藏沙蜥Phrynocephalustheobaldi、红瘰疣螈Tylototriton

verrucosus、kweichowensis贵州疣螈Tylototriton、喜山岩蜥Laudakiahimalayana树蜥Calotes、变色

versicolor、青海沙蜥Phrynocephalusvlangalii、pinchonii山溪鲵Batrachuperus、东方蝾螈Cynops

orientalis等。

3

DB45/T1856DB45/T—2018

BB

附附录B

（规范性附录）（规范性附录）

蛤蚧及其伪品DNACOI序列

B.1B.1蛤蚧chinensisGekko562bp

gaattaagtcaaccaggagcactccttggaaacgaccaactatacaatgtaatcgtaacagcacacgcatttgtaataat

cttctttatacttctttatagtgatgcctgttataatcggggggtttggcaattgattagtccccctaataattggcgcaccggacatag

cttttccacgaataaacaacataagcttctgactgctccccccagcattattcctcctactagcctccgcgagtgtgga

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catcttttcccatcttttccttacacctagctggagtctcttccatcttaggggccatcaattttatcaccacctgcattaatataaaac

ccccaagcataacccaatacacgacacccctgtttgtatgatcggttctaattactgccgtactacttctcctagcacta

ccagtgcttgccgccggcactatactcatgctgaccgaccgtttcacatcattctaaccttaagaccctgccggaggcgggg

B.2B.2无蹼壁虎swinhonisGekko825bp

atgtttacccgttgatttctctcaacaaaccataaagacattggcaccctatatttactgtttggtgtatgagccggcat

agtgggcacagcactgagcttgttaattcgcgcggagttaagccagcctggggcactactaggggatgatcagatctata

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actgctactacttctcgcttcttccggagttgaagcaggtgctggaaccggttgaactgtctatcccccattagcagcta

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attaattaccattaattaccgccgtactactcttacttgccctaccggttctggctgccggaattactatacttctaaccgaccgcaacc

ttaacactacttaacactacattctttgaccctgcggggggcggagatcctgtactatatcaacacctattctgattttttgggcaccca

gaagtatatattttaattcttcccggattcggcatagtatcgcatatcattacgtactatgcaggaaaaaaagaaccgtt

cggctacatggggatagtctgggct

B.3B.3中国瘰螈chinensisParamesotriton2690bp

gttaaggtggcagagcccggtaattgcaaaagacctaagccctttccaccagaggttcaattcctcttcttaactgtgta

tactatatcctactatatccgccctcttaaacccattactatatattatcccagtattattagccgtggcctttttaactcttgttgaac

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