DB4201/T 540-2018 重要动物疫病监测样品采集技术规范

ICS65.020.01

B41

DB4201

武汉市地方标准

DB4201/T540-2018

重要动物疫病监测样品采集技术规范

2018-08-28发布2018-09-28实施

武汉市质量技术监督局发布

DB4201/T540-2018

前言

本规范按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本规范附录A、附录B为资料性附录。

本规范由武汉市动物疫病预防控制中心提出。

本规范由武汉市农业委员会归口。

本规范起草单位：武汉市动物疫病预防控制中心、烟台出入境检验检疫局、蔡甸区动物疫病预防

控制中心。

本规范主要起草人：张四化、尹伟力、阮征、刘开武、王雪、万云、赵静、吴建英、陈橙、吴颢、

杜娜、宫时玉。

本规范首次发布。

I

DB4201/T540-2018

重要动物疫病监测样品采集技术规范

1范围

本规范规定了重要动物疫病监测样品采集的一般要求，包括采样原则和要求、样品类别和数量、采

样前准备、样品采集、采样记录、样品的包装、样品的保存和运输等。

本规范适用于本地动物防疫机构技术人员及养殖企业技术人员开展相关采样工作。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

NY/T3075畜禽养殖场消毒技术

中华人民共和国农业部农医发2017年第25号病死及病害动物无害化处理技术规范

中华人民共和国农业部公告第503号高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

重要动物疫病

被本地政府列入强制免疫范围的动物疫病，或需进行优先防治的动物疫病、人畜共患病及其他对畜

禽生产影响较大被列入本地监测计划的动物疫病。

3.2

监测

采用规定的标准和方法，持续对特定群体中疫病的发生、流行、分布及相关因素进行观察与检测的

过程。

3.3

样品

取自动物及其产品或环境，拟通过相关检测反映动物个体、群体或环境有关状况的材料或物品。

3.4采样

按照规定的程序和要求从动物及其产品或环境取得样品的过程。

3.5

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无菌操作

用于防止微生物进入样品或其它无菌范围的操作技术。

4采样原则和要求

4.1采样人员必须是兽医技术人员，具备动物传染病相关知识，熟练掌握各种采样技术。

4.2个人安全防护和消毒隔离按照NY/T3075的要求执行。

4.3凡发现动物有急性死亡，在排除炭疽后方可剖检、取样。

4.4解剖时先胸腔后腹腔，先取实质性器官，后取肠道等易污染的组织器官及内容物。

4.5病死动物要在隔离区（下铺塑料布）或实验室剖检、取样，剖检后的动物尸体、废弃物等要按《病

死及病害动物无害化处理技术规范》进行无害化处理。

5样品类别和数量

5.1样品类别

5.1.1抗体监测样品包括全血、血清、禽蛋等；

5.1.2病原监测样品包括分泌物、组织、粪便、精液、皮肤样品等。

5.2样品数量

根据本地监测计划，结合养殖场（户）实际情况，确定监测的具体比例和数量。可参考《场群内个

体抗体监测抽样数量表》和《场群内个体病原学监测抽样数量表》（见附录B.1和附录B.2）。

6采样前准备

6.1采样用品

6.1.1血液采集用品

一次性注射器、镊子、碘酊、75%酒精棉、干棉球、采血针、采血管、保定动物专用工具等。

6.1.2禽蛋采集用品

格状专用盛蛋盘等。

6.1.3拭子采集用品

无菌棉拭子、剪刀等。

6.1.4组织采集用品

解剖刀、剪刀、镊子、扁桃体采样器、灭菌牙签、酒精灯等。

6.1.5其他采集用品

金属探杯（采集牛羊O-P液）、塑料桶、全棉绳（采集猪口腔液）等。

6.2存放用品

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塑料离心管（2mL、10mL、15mL、50mL）、玻璃容器、自封袋、试管架、离心管存放盒、铝盒、

封口膜、冷冻剂、防震材料、采样箱、保温箱、胶布等。

6.3防护用品

口罩、一次性PE手套或乳胶手套、防护服、防护帽、防护眼镜、胶靴、消毒液等。

6.4样品保存液

6.4.2根据所采样品的种类和要求，准备不同类型并分装成适量的保存液。

6.4.3pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS，配制方法见附录A.1）

6.4.4pH7.4甘油PBS（配制方法见附录A.2）

6.4.5棉拭子保存液（配制方法见附录A.3）

6.4.6粪便保存液（配制方法见附录A.4）

6.4.730％甘油PBS（配制方法见附录A.5）

6.4.850％甘油PBS（配制方法见附录A.6）

6.5记录用品

不干胶标签、签字笔、圆珠笔、油性记号笔、采样登记表和样品编号表（见附录B.3、附录B.4、附

录B.5）等。

7样品采集技术

7.1血液

7.1.1采血部位

7.1.1.1应根据动物种类确定采血部位，不同动物的采血部位见附录B.6。

7.1.1.2采血部位的皮肤应先剃毛（拔毛）、清洁，用1％～2％碘酊消毒后，再用75％酒精棉球由内

向外螺旋式脱碘消毒，干燥后穿刺采血。

7.1.2采血方法

7.1.2.1猪前腔静脉采血

仔猪或中等大小的猪适用前腔静脉采血，参照NY/T541中6.1.2.2规定执行。

7.1.2.2猪耳缘静脉采血

体型较大的猪适用耳缘静脉采血，参照NY/T541中6.1.2.1规定执行。

7.1.2.3牛尾静脉采血

牛尾静脉位于牛尾腹侧面的中心线皮下位置，采血时将牛尾上提，在离尾根10cm左右中点凹陷处，

将注射器针头垂直刺入约1cm，见有血液回流时，把注射器活塞向外拉使血液流入针筒。

7.1.2.4牛、羊、马颈静脉采血

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颈静脉位于颈部侧面颈静脉沟内，采血时将牲畜保定，手指压迫颈静脉近心端，使血管怒张，针头

与皮肤呈45°角由下向上刺入血管，见有血液回流时，把注射器活塞向外拉使血液流入针筒。

7.1.2.5禽翅静脉采血

禽侧卧保定后，将禽翅翻开，暴露翅静脉，拇指按压翅静脉近心端，使之怒张，针头由近心端向远

心端方向平行刺入静脉，放松对近心端的按压，缓慢抽取血液。

7.1.2.6禽心脏采血

参照NY/T541中6.1.2.6规定执行。

7.1.3血样的处理

7.1.3.1全血

将采集的全血立刻注入装有抗凝剂的试管中，轻轻摇动，充分混匀。血液抗凝可选用以下四种方法：

a)5mL全血加入0.1mL10％乙二胺四乙酸二钠溶液。

b)5mL全血加入0.5mL3.8％枸椽酸钠（柠檬酸钠）溶液。

c)5mL全血加入0.1mL1％肝素钠溶液。

d)使用市售商品抗凝管。

7.1.3.2血清

7.1.3.2.1将采集的全血在室温下（20℃～25℃）倾斜30°角放置2小时～4小时，待全血凝固并析出

血清后，将血清注入无菌离心管，离心后取上清液备用。

7.1.3.2.2采集动物血样时，注射器或采血管应保留1/2或1/3的空气，以便析出血清。

7.2禽蛋

7.2.1采集方法

随机采集规模化禽场、养禽专业户、散养农户的不同养殖单元的禽蛋，禽蛋要求无破损，置于洁净

卫生的格状专用盛蛋盘中。

7.2.2卵黄抗体的提取

提取卵黄液，将卵黄液、生理盐水、氯仿按1:1:2比例混匀后静置30分钟，3000r/min离心20分钟，

取上层清液备用（氯仿体积不计，待检样品按被稀释2倍计算）。

7.3拭子

7.3.1禽咽喉-泄殖腔双拭子

将一个棉拭子插入喉头口及上颚裂处来回刮3次～5次取咽喉分泌液，将另一个棉拭子插入泄殖腔

约1.5cm～2cm，旋转2圈～3圈取泄殖腔内容物，将两个拭子的样品端插入同一个含1mL棉拭子保存液

（配制方法见附录A.3，下同）的离心管中，剪下或折断尾部，盖上管盖并做好标记。

7.3.2禽环境拭子

7.3.2.1禽内环境拭子

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用棉拭子擦拭笼具表面、笼具周围、垫料、饲槽、饮水、粪便等禽舍内环境部位，分别置于含1mL

棉拭子保存液的离心管中，剪下或折断尾部，也可用多个拭子充分擦拭后置于一个离心管中，盖上管盖

并做好标记。

7.3.2.2禽外环境拭子

用棉拭子擦拭禽舍外的地面、出入道路、污水、运送工具等处，置于含1mL棉拭子保存液的离心管

中，剪下或折断尾部，盖上管盖并做好标记。

7.3.3羊口鼻拭子

用棉拭子刮取羊口腔黏膜分泌物，取另一个棉拭子插入羊鼻腔约2~3cm，旋转后沾上分泌物，将拭

子样品端一并置于含有1mL棉拭子保存液的离心管中，剪下或折断尾部，盖上管盖并做好标记。

7.4分泌物

7.4.1牛、羊食道-咽部分泌物（O-P液）

7.4.1.1采样前禁食12小时，适量饮水，避免采样时胃内容物反流污染O-P液。采样前将O-P液探杯置

于2％～3％的氢氧化钠溶液浸泡5分钟消毒，再用清水冲洗后使用。每采完一头动物，探杯要重复消毒

并充分清洗。

7.4.1.2采样时，动物站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部10cm～15cm处，轻轻来回抽动

2次～3次，再将探杯拉出，采集2mL～5mLO-P液，倒入含有等量pH7.4甘油PBS的离心管中，盖上管

盖并做好标记。

7.4.2猪口腔液

将直径1.3cm的全棉绳用于保育猪、直径1.6cm的绳子用于生长育肥猪和生产公母猪口腔液采集。

全棉绳上端固定在猪圈栏杆上，下垂高度与猪只的肩关节齐平，悬挂处应远离饲槽和猪排便区，任猪咀

嚼，30分钟后收取棉绳，刮取和挤压口腔液至灭菌自封袋内，然后将自封袋内液体转入离心管，盖上管

盖并做好标记。每份样品1mL以上为有效采集量。

7.5组织

7.5.1扁桃体

7.5.1.1从活体采集扁桃体样品时，应使用专用扁桃体采集器。

7.5.1.2采样前将采样器置于2％～3％的氢氧化钠溶液浸泡5分钟消毒，再用清水冲洗后使用。每采

完一头动物，采样器要重复消毒并充分清洗。

7.5.1.3采样时，用保定绳将猪只固定，再用开口器撬开猪嘴，顶住上额、压住舌头，卡住下巴，看

到突起的扁桃体后，迅速进枪，顶住腭扁桃体（切忌滑动或搅动，以免创口过大），迅速扣动扳机，拉

出刀杆，用灭菌牙签将样品从刀槽中挑至灭菌离心管中，盖上管盖并做好标记。

7.5.2脏器组织

7.5.2.1根据疑似病种选择优先采集的脏器组织，采集有病变的部分，或采集病变和健康组织交界处。

动物主要疫病病原监测采样部位见附录B.7。

7.5.2.2用消毒的器械切取所需脏器组织块，每取一份组织块，应用火焰消毒剪刀镊子等采样器械，

防止组织间相互污染，采集的组织块分别放入灭菌的容器或自封袋内。

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7.6粪便

7.6.1一般动物粪便

7.6.1.1少量采集时，以灭菌的棉拭子从直肠深处或泄殖腔黏膜上蘸取粪便，立即置于含1mL粪便保

存液（配制方法见附录A.4，下同）的离心管中，盖上管盖并做好标记。

7.6.1.2多量采集时，可将动物肛门周围消毒后，用器械或戴上手套的手伸入直肠内取粪便，也可用

压舌板插入直肠，轻轻用力下压，刺激排粪，收集粪便，装入灭菌容器内，封口标记。

7.6.2野生动物粪便

野生或珍稀动物采集新鲜粪便样品，每份样品1g～2g，置于内含1mL粪便保存液的离心管中，盖

上管盖并做好标记。

7.7精液

消毒液洗净阴茎，用假阴道挤压阴茎或人工刺激的方法采取精液。将集精杯从假阴道上取下，装入

灭菌容器中，封口标记，样品中不得加入防腐剂。

7.8皮肤样品

用消毒的剪刀剪下1g～2g动物的病变皮肤如新鲜的水泡皮、结节、痂皮等，加入含1mL50％甘

油PBS的离心管中，封口标记。

8采样记录

8.1样品编号

在离心管管盖或管壁、自封袋上用记号笔做好标记，或用签字笔填写标签贴在样品包装上，同一动

物种类的样品，从“1”开始顺序编号，在数字前加上不同动物种类代码：猪“Z”，牛“N”，羊“Y”，

鸡“J”，鸭“A”，其他“Q”。

8.2采样登记

采样登记表信息应包括采样地址、被采样场（户）名、场点类型、联系人、电话、动物种类、样品

类别、养殖规模、采样数量、编号、品种、日龄、群体数量、免疫信息、发病情况等。采样登记表应用

签字笔逐项填写（一式二份），填写的信息应准确、完整，字迹清晰、工整。将采样登记表和病史资料

装在自封袋中，一份随样品送实验室，另一份留存备案。各类监测采样登记表、样品编号表见附录B.3、

附录B.4、附录B.5。

9样品的包装

9.1装载样品的容器必须完整无损，密封不漏液。用前清洁干净，必要时经高温干热、紫外线照射或

高压蒸汽灭菌后使用。

9.2根据样品性质及检验目的选择不同的容器，容器装量不可过多，液态样品不可超过容量的80%，

以防冻结时容器破裂。

9.3自封袋外粘贴标签，注明采样场点、样品名称和数量、采样日期等，并将各个样品放到自封袋中。

9.4装载样品的小塑料离心管应放在规定的离心管盒内，装载血液的注射器和玻璃容器应用铝盒盛放，

盒内加填防震材料避免样品晃动。

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9.5自封袋、塑料盒及铝盒外应贴封条，封条上应有采样人签章，并注明贴封日期，标注放置方向。

9.6对疑似高致病性动物疫病的样品包装参考《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包

装规范》。

10样品的保存和运输

10.1根据样品性质及检验目的确定保存方法，不同样品的保存方法见附录B.8。

10.2样品采集、处理后，应于24小时内送抵实验室进行检测，运送时维持样品环境处于2℃～8℃低

温状态；24小时内不能送检的，根据不同检验要求，按所需温度分类保存于冰箱或冰柜。

10.3未完成血清分离的全血样品，待血清析出后方能运输，途中严禁振荡，以免溶血。

10.4样品密封后置于保温箱中运送，内置适当冷冻剂和防震材料。

10.5样品运送应符合生物安全要求，外包装上加贴生物安全警示标志，运送高致病性病原微生物样品

应按照《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范》的规定执行。

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附录A

（资料性附录）

样品保存液的配制

A.1pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）

氯化钠（NaCl）8.0g

氯化钾（KCl）0.2g

磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）2.9g

磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g

蒸馏水（或无离子水）加至1000mL，充分溶解

A.2pH7.4甘油PBS

在pH7.4PBS（A.1）中加入甘油（丙三醇），体积比例为10％～20％，调pH值至7.4，103.4Kpa

高压灭菌20分钟，冷却后4