GB/T 18089-2008 蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和抗体检测技术

ICS11.220

B41

中华人民共和国国家标准

GB/T18089—2008

代替GB/T18089—2000

蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和

抗体检测技术

Isolation,identificationandserumneutralizationantibody

testinBluetonguevirus

2008-12-31发布2009-05-01实施

发布

GB/T18089—2008

-1.Z-—1—

刖弓

本标准代替GB/T18089—2000«蓝舌病微量血清中和试验及病毒分离和鉴定方法》。

本标准与GB/T18089—2000相比主要变化如下：

——对标准名称进行了修改；

——删除了蓝舌病病毒鉴定中的病毒中和试验部分；

——增加了病毒鉴定中RT-PCR方法的鉴定。

本标准的附录A为规范性附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检

疫局。

本标准主要起草人:周晓黎、杨建明、艾军、花群义、杨晓花、张其艳、严树、董俊、叶玲玲、徐维加。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

——GB/T18089—2000o

T

GB/T18089—2008

蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和

抗体检测技术

1范围

本标准规定了蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和抗体检测的技术。

本标准适用于蓝舌病病毒的分离、鉴定及动物感染蓝舌病病毒后血清中和抗体的检测。

2符号和缩略语

下列符号和缩略语适用于本标准。

bhk21——幼仓鼠肾细胞株；

BLP——乳糖蛋白豚缓冲肉汤；

BT蓝舌病；

bp碱基对；

CPE——致细胞病变作用；

C6/36——蚊子细胞株；

DEPC——焦碳酸二乙酯；

SPF——无特定病原体；

TCID50——半数组织培养感染量；

Veto——非洲绿猴肾细胞株。

3蓝舌病病毒分离

3.1材料

10日龄〜11日龄SPF鸡胚。

3.2设备与器材

鸡胚开孔器、照蛋灯或照蛋箱、乳钵或组织捣碎器、倒置显微镜。

3.3试验程序

3.3.1样品

肝素抗凝血（每5mL血液用10IU肝素）、脏器（脾、肝、肾、淋巴结）、精液、库螺。用于病毒分离的

样品应置冷藏容器中保存，在24h内送到实验室，并立即进行处理。

3.3.2血液样品制备

取肝素抗凝血5mL,用磷酸盐缓冲液（PBS,配方见附录A）洗涤血样3次〜4次，每次2000r/min

离心10min,弃上清液后加入倍量BLP（配方见附录A）,置冰浴中用超声波处理（40卩A、1min）o经处

理的样品当天使用，使用前置4°C保存，剩余样品置一70C保存备用。

3.3.3组织样品制备

无菌采集动物脾、淋巴结、肝、肾各5g,剪碎后加入BLP10mL（含青霉素2000IU/mL.链霉素

2000卩g/mL）,置乳钵中研磨,4C冰箱中浸提4h,取上清液5mL用超声波裂解处理（100卩A、1min〜

2min）或冻融三次,3000r/min离心20min,取上清液使用，使用前置4C保存，剩余样品置一70€保

存备用。

3.3.4精液样品制备

取精液样品0.5mL,用BLP作1：5稀释后，3000r/min离心20min,弃上清液，再用BLP作

1

GB/T18089—2008

1:5稀释，充分混匀，置冰浴中用超声波处理（100ptA、lmin〜2min）或冻融三次，3000r/min离心

20min,取上清液使用，使用前置4C保存，剩余样品置一70C保存备用。

3.3.5库蟻样品制备

取200个〜300个库蝶盛于小试管中，加入含青霉素2000IU/mL、链霉素2000Mg/mL的BLP3mL~

5mL,置冰浴中研磨虫体，3000r/min离心20min,取上清液使用，使用前置4"C保存，剩余样品置

—70°C保存备用。

3.3.6鸡胚静脉接种

3.3.6.1选择10日龄〜11日龄发育良好的SPF鸡胚，在照蛋灯上标记静脉位置和开孔区，用开孔器

开窗备用。

3.3.6.2在无菌条件下，每份样品接种5个鸡胚，每个鸡胚静脉接种0.1niL,接种后用擦镜纸封口，置

33.5°C培养。

3.3.6.3逐日观察并记录，24h内死亡的鸡胚为非特异性死亡，将48h后死亡的鸡胚收置4C冰箱保

存，于接种后第6天同未死亡鸡胚一起收毒。

3.3.7收毒

在无菌条件下，用碘酒、酒精棉球对鸡胚气室处进行消毒，凿开蛋壳，按常规方法剪破壳膜、尿囊膜、

羊膜后，取出胚体，置平皿中，在每个胚体上取若干组织块（有病变时，取病变组织），置组织捣碎器或乳

钵中研磨后，按1：5加入BLP（含青霉素2000IU/mL、链霉素2000“g/mL），置4C冰箱浸提4h,当

日使用，剩余样品置一70€保存备用。

3.3.8接种敏感细胞

3.3.8.1按常规方法在12孔细胞培养板上制备C6/36细胞单层。

3.3.8.2将收获的鸡胚上清液，接种细胞单层，每份病料接种两孔，每孔接种0.1mL,置25C培养，第

2天换液后，培养7d。

3.3.8.3按常规方法在12孔细胞培养板卜制备BHK九或Vero细胞单层"

3.3.8.4第7天用吸管吹下被接种的C6/36细胞。

3.3.8.5将吹下的C6/36细胞悬液接种于BHK21或Vcro细胞单层，37°C吸附1h后，加入维持液置

37°C培养。24h后逐日观察细胞病变，连续观察7d。如盲传两代出现细胞病变，则应进行荧光抗体、

PCR试验进行鉴定；如无细胞病变，则判定为病毒分离阴性。

4蓝舌病病毒鉴定

4.1荧光抗体试验（直接法）

4.1.1材料

荧光标记的蓝舌病病毒单克隆抗体。

4.1.2设备与器材

倒置荧光显微镜、96孔细胞培养板。

4.1.3试验程序

4.1.3.1将接种的BHK21或Vcro细胞培养物冻融一次，1000r/