DB33/T 2405-2021 猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法

ICS65.020.30

CCSB41

33

浙江省地方标准

DB33/T2405—2021

猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双

重荧光RT-PCR检测方法

Dualreal-timeRT-PCRmethodfordetectionofporcinedeltacoronavirus

andporcineepidemicdiarrheavirus

文稿版次选择

（本稿完成日期：）

2021-12-12发布2022-01-12实施

浙江省市场监督管理局发布

DB33/T2405—2021

前言

本标准按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由浙江省农业农村厅提出。

本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：浙江大学、浙江省动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：赵灵燕、冯肖肖、吴贇竑、李肖梁、方维焕、单颖、谢荣辉、徐计东、毕淑珍、

刘爱军、吴雪军、黄晓兵、周蕾、章杭建。

I

DB33/T2405—2021

猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法的术语和定义、缩略

语、仪器、耗材和试剂、样品采集和处理、荧光RT-PCR操作程序、结果判定及生物安全措施。

本标准适用于猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

标准。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则

SN/T4835实验室生物废弃物管理要求

3术语与定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

RT-PCR

反转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction），将RNA的反转录

(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。

4缩略语

下列缩略语适用于本标准。

β-Actin：肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白，其在不同物种之间高度保守，是PCR常用的内

部参照。

Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定阈值时所经历的循环数（cyclethreshold）。

DEPC：焦磷酸二乙酯（diethyipyocarbonate）。

DNA酶：脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease）。

PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsolution）。

PDCoV：猪德尔塔冠状病毒（porcinedeltacoronavirus）。

PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus）。

1

DB33/T2405—2021

RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）。

RNA酶：核糖核酸酶（ribonuclease）。

RT-EnzymeSolution：反转录酶溶液（reversetranscriptionenzymesolution）。

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）。

Taqman探针：一种检测寡核苷酸的荧光探针。

TE缓冲液：Tris-EDTA缓冲液（tris-EDTAbuffer）。

5仪器

5.1荧光PCR检测仪。

5.2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。

5.3组织研磨器或者研钵。

5.4分析天平。

5.5生物安全柜。

5.6冰箱：可温控在2℃～8℃和-20℃～-40℃。

5.7超低温冰箱：可控温至-70℃以下。

5.8微量移液器：2µL、10µL、100µL、200µL、1000µL，并配备与移液器匹配的吸头。

5.9高压灭菌锅和干燥箱：可温控至160℃。

6耗材和试剂

6.1无RNA酶的1.5mL离心管。

6.2无RNA酶的0.2mLPCR管或八联管及各种规格吸头。

6.3除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。

6.4Trizol：商品化RNA抽提试剂，2℃～8℃保存。

6.5RNA提取试剂盒：商品化RNA病毒核酸提取试剂盒。

6.6氯仿和异丙醇：-20℃预冷。

6.775%乙醇：无水乙醇和双蒸水配制，-20℃预冷。

6.8DEPC水：参照附录A配制，也可购买商品化DEPC水。

6.9PBS（0.01mol/L，pH7.2）：参照附录A配制，也可购买商品化PBS。

6.10引物和TaqMan探针：其序列见附录B，由生物公司合成，用TE溶液溶解并稀释至100µmol/L

存储液，-20℃保存备用；根据需要配制成10µmol/L工作液，-20℃保存供检测使用。

6.11病毒阳性对照和阴性对照：猪德尔塔冠状阳性对照样品和猪流行性腹泻阳性对照样品分别为携带

检测靶序列的质粒（质粒及其检测靶序列见附录C），阴性对照样品为空质粒。

6.12内参对照阳性对照样品和阴性对照样品：内参对照阳性对照样品为带有猪β-actin基因的质粒；

内参对照阴性对照样品为空质粒。

7样品采集和处理

7.1采样工具

7.1.1手术刀、剪刀、镊子，经121℃湿热灭菌30min。

7.1.2一次性无菌采样拭子和采样管。

2

DB33/T2405—2021

7.1.3组织研磨器或者研钵，经160℃干热灭菌2h。

7.2样品采集

7.2.1粪便或肠内容物采集

将一次性无菌采样拭子用无菌PBS浸湿后，蘸取粪便或肠内容物（不少于0.5g），置于无菌采样管

中备用。

7.2.2肛拭子采集

大猪使用保定器保定，小猪可以双手保定，将一次性无菌采样拭子用无菌PBS浸湿后，探入直肠2

cm～3cm、旋转3次～5次后，取出含有直肠内容物肛拭子，置于无菌采样管中备用。

7.2.3组织样品采集

用7.1.1处理过的器械，取肠道组织（不少于5g），置于无菌采样管中备用。

7.3样品保存和运输

上述采集的样品宜立即进行检测。不能立即检测的样品，在2℃～8℃条件下保存不应超过24h，

-25℃～-15℃条件下保存应不超过1个月，-70℃以下条件保存应不超过6个月。样品运送采用低温保

存进行运输，并在规定温度下的保存期内送达。

7.4样品处理

7.4.1粪便或肠内容物

取0.5g～2.0g粪便或肠溶物加入500µL无菌PBS，冻融1次～2次，充分涡旋震荡1min，于4℃下以

3000r/min转速离心5min，取上清装于1.5mL灭菌管，用于后续的核酸提取。

7.4.2肛拭子

肛拭子采样管中加入500µL无菌PBS，冻融1次～2次，充分涡旋震荡1min，于4℃下以3000r/min

转速离心5min，取上清装于1.5mL灭菌管，用于后续的核酸提取。

7.4.3组织样品

取1.0g～2.0g组织，剪碎，加入1mL无菌PBS进行研磨，制备组织匀浆，冻融1次～2次，于4℃下

以8000r/min转速离心5min，取上清装于1.5ml灭菌管，用于后续的核酸提取。

8荧光RT-PCR操作程序

8.1RNA提取

8.1.1按下列步骤完成RNA提取，并用无RNA酶活性的DNA酶处理，也可采用商品化的病毒RNA提取试剂

盒。

8.1.2取n个灭菌的1.5mL离心管（n为待检样品数），对每个离心管进行编号。

8.1.3每管加入750µLTrizol，加入被检样品250µL，用力上下反复颠倒数次或涡旋振荡30s，静置5

min。再加入200µL预冷的氯仿，震荡混匀，静置5min，于4℃条件下以12000r/min转速离心15min。

3

DB33/T2405—2021

8.1.4取与8.1.2中相同数量的灭菌1.5mL离心管，并对每个离心管进行编号。取8.1.3中离心后的上

清液（注意不要吸出中间层）转移至相应的管中，加入等体积预冷异丙醇，混匀，静置30min。

8.1.5于4℃条件下以12000r/min转速离心15min，弃上清，缓缓加入1mL75%预冷乙醇，颠倒洗涤沉

淀及管壁。

8.1.6于4℃条件下以12000r/min转速离心10min，弃上清，室温条件下干燥后，加入30.0µLDEPC

处理水，轻轻混匀，溶解管中的RNA，以4000r/min转速