LY/T 2426-2015 枣品种鉴定技术规程 SSR分子标记法

ICS65.020

B60

中华人民共和国林业行业标准

/—

LYT24262015

枣品种鉴定技术规程

SSR分子标记法

ㅤㅤㅤㅤ

TechnicalreulationsfortheidentificationofChineseuube

gjj

()—

ZizihusuubaMillcultivarsSSRmarkermethod

pjj

2015-01-27发布2015-05-01实施

国家林业局发布

/—

LYT24262015

枣品种鉴定技术规程

SSR分子标记法

1范围

本标准规定了利用简单重复序列(,)分子标记对枣(

simleseuencereeatSSRZizihusuuba

pqppjj

)品种指纹鉴定的试验方法。

MillDNA

本标准适用于基于SSR分子标记技术构建的DNA指纹图谱对枣品种DNA分子数据采集和品种

鉴定。

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文

。,()。

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/分析实验室用水规格和试验方法

GBT6682

/、

植物新品种特异性一致性和稳定性测试指南总则

GBT19557.1

/—、、

植物品种特异性一致性稳定性测试指南枣

LYT21902013

ㅤㅤㅤㅤ

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

核心引物corerimer

p

,、、,

人工合成的多态性稳定性重复性等综合特性较好用于品种DNA指纹鉴定必须选用的一套

SSR引物。

3.2

SSR指纹图谱SSRfinerrint

gp

,

基于SSR分子标记鉴别生物个体之间差异的DNA电泳图谱通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管

,。

电泳得到不同大小的DNA片段图谱

3.3

参照品种referencecultivar

,。

多样性好核心引物位点扩增片段大小已知的一组品种参照品种用于比对待测样品在某个SSR

,。

位点上等位变异扩增片段的大小校正不同仪器设备和不同实验室间检测数据的系统误差

3.4

待检样品testsamle

p

、、。

送检单位提供的待鉴定的枣种质品系品种

3.5

对照品种controlcultivar

,;

与待检样品近似的品种用于与待检样品进行对比或指已知品种中与待检样品相似度最高的

品种。

1

/—

LYT24262015

4原理

,。

SSR广泛分布于枣基因组中不同枣品种每个SSR位点的重复基元重复次数可能不同设计特异

(,),

性引物对重复序列进行聚合酶链反应olmerasechainreactionPCR扩增扩增产物的片段长度可以

py

,。

通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色或通过毛细管电泳技术加以区分不同的枣品种间遗传

,,。

组成存在差异某些SSR位点重复次数不同显示不同的谱带从而实现品种差异鉴定

5仪器设备及试剂

,。。

除非另有说明本标准所用试剂均为分析纯仪器设备及试剂参见附录A

6溶液配制

/,。

所有用水按照GBT6682的要求相关溶液配制方法参见附录B

7核心引物

,。

核心引物相关信息见附录附录中的参考品种及代码参见附录

CCD

8枣样品DNA指纹图谱鉴定及其使用

ㅤㅤㅤㅤ

。,

枣样品DNA指纹图谱鉴定报告书参见附录E在进行等位变异检测时应同时包括相应参照品

。,

种的编号及名称同一名称不同来源的对照品种的某一位点上的等位变异可能不相同在使用其他来

,,。,

源的参照品种时应与原参照品种核对确认无误后使用对于附录中未包括的等位变异应按本标

D

,。

准方法确定其大小和对应参照品种

9操作程序

9.1样品准备

、,,

试验样品为待鉴定枣样品和对照品种的叶片枝条等器官或组织最好为幼嫩叶片采样后在4℃

。。

贮藏条件下送至检测机构选用个个参照品种同时进行分析

2~3

9.2DNA提取

按以下步骤进行DNA提取:

),,,

a称取样品组织材料0.30g放入-20℃预冷的研钵中加入液氮迅速研磨至粉末状后立即用

,()

预冷的药匙转移至2mL离心管中依次加入1mL预热65℃的DNA提取缓冲液和

,。

巯基乙醇充分颠倒混匀

50L-

μβ

),,。

b65℃恒温水浴50min每隔10min轻轻颠倒混匀一次12000g常温下离心10min

),//(,),,

c取上清液加入等体积的水饱和酚氯仿异戊醇25∶24∶1体积比轻轻颠倒混匀静置

,。

10min于常温下12000g离心10min

),,/(,),

d取上清液转入另一个2mL离心管中加入等体积的氯仿异戊醇24∶1体积比轻轻颠倒

,,离心。

混匀静置于10min

10min4℃12000g

2

/—

LYT24262015

),,,

e吸取上清液于新的1.5mL离心管中加入等体积-20℃预冷的异丙醇沉淀DNA颠倒混匀

在下静置;,,。

-20℃30min12000g4℃离心10min弃上清液

),,,。

沉淀的用乙醇洗涤两次离心后风干溶于超纯水中保存待用

fDNA70%200L-20℃

μ

:。

注其他所获质量能够满足扩增需要的提取方法都适用于本标准

DNAPCRDNA

9.3PCR扩增

9.3.1SSR引物

使用的核心引物及其序列见附录C。

9.3.2PCR反应体系

,,:

利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时PCR反应体系为10L包括成分为20n~25n基因组

μgg

,,,/,

DNATaDNA聚合酶1.0U1×PCR缓冲液每种dNTPs0.2mmolL正向引物和反向引物各

q

/,。

0.2molL剩余体积用超纯水补足至10L

μμ

,:,

利用毛细管电泳检测时PCR反应体系为10L包括成分为20n~25n基因组DNATa

μggq

,,/,

DNA聚合酶1.0U1×PCR缓冲液每种dNTPs0.2mmolLM13荧光标记引物和反向引物各

/,/,。

3.2molL正向引物0.8molL剩余体积用超纯水补足至10L

μμμ

9.3.3PCR反应程序

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时,反应程序为:预变性,变性,

PCR94℃5min94℃30s50℃~

(),,;,

根据附录引物退火温度设定退火延伸共个循环延伸

65℃C40s72℃45s3272℃5min4℃

保存。

ㅤㅤㅤㅤ

毛细管电泳检测时,:;,(

PCR反应程序为94℃预变性5min94℃变性30s50℃~65℃根据附

),,;,,

录引物退火温度设定退火延伸共个循环变性退火

C40s72℃45s3094℃30s53℃40s

延伸,个循环;延伸,保存。

72℃45s872℃5min4℃

9.4PCR产物检测

9.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(,)

olacrlamideelelectrohoresisPAGE

pyygp

9.4.1.1清洗玻璃板

。,。

用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净并晾干用无水乙醇擦洗遍吸水纸擦干小玻璃板用

21mL

,。。

剥离硅烷处理大玻璃板用3mL预混的亲和硅烷工作液处理操作过程中防止两块玻璃板互相污染

9.4.1.2组装电泳板

,,,

将两块玻璃板晾干以0.4mm的边条置于大玻璃板左右两侧将小玻璃板压于其上并固定用胶

;,。

带封住底部在两玻璃板两侧在有边条处用夹子夹住注意间距

9.4.1.3配胶及灌胶

,。。

按附录配制的变性胶溶液轻轻混匀后灌胶灌胶过程中防止出现气泡待

B50mL6%PAGE

,。

胶液充满玻璃板夹层将0.4mm厚鲨鱼齿梳平齐端向里轻轻插入胶液约0.5cm处室温下聚合1h

。,,,。

以上待胶聚合后清理胶板表面溢出的胶液轻轻拔出梳子用水清洗干净备用

9.4.1.4预电泳

()(),()

正极槽下槽中加入1×TBE缓冲液没过下槽高度的80%在负极槽上槽加入1×TBE缓

3

/—

LYT24262015

(),。

冲液没过短玻璃板上端1cm60W恒功率预电泳30min

9.4.1.5变性

(),,

把PCR扩增产物与凝胶加样缓冲液按5∶1体积比混合95℃变性5min立即置于冰上冷却

待用。

9.4.1.6电泳

,。,,。

用吸球吹吸加样槽清除气泡和残胶将梳子反过来把梳齿端插入凝胶2mm形成加样孔每

,。,

个加样孔点入3L扩增产物在胶板两侧点入DNA分子量标准在60W恒功率电泳溴酚蓝至胶的

μ

,。

四分之三处时终止电泳

9.4.1.7银染

按以下步骤进行银染:

):,,,

a固定电泳结束后小心分开两块玻璃板把附着凝胶的玻璃板放入盛有固定液的托盘中放在

,;

摇床中轻摇直至溴酚蓝颜色褪去回收固定液

):,,,;

漂洗取出胶板放入水洗框中用蒸馏水清洗凝胶次每次

b22min

):,,;

c染色将凝胶放入染色液中在摇床上轻摇避光染色30min

):,,;

d漂洗弃掉染色液用蒸馏水轻轻漂洗一次冲洗凝胶不超过10s

):,,;

e显影凝胶放到预冷的显影液中置摇床上轻摇直到条带清楚可见

):,;

f定影待条带清晰后将胶板放入回收的固定液中定影10min

):。

g漂洗用蒸馏水清洗胶板1min

9.4.1.8PCR扩增产物的谱带分析ㅤㅤㅤㅤ

,。

干燥后扫描或拍照成像并保存参照DNA分子量标准进行谱带判定

9.4.2毛细管电泳荧光检测

9.4.2.1样品准备

()()

对6-FAM6-Carboxfluorescein和HEXHexachlorofluorescein荧光标记的PCR产物用超纯水

y

稀释倍,()和()荧光标记的

30ROXCarbox-X-RhodamineTAMRACarboxtetramethlrhodamine

yyy

。,

产物用超纯水稀释倍混合等体积的上述四种稀释液从混合液中吸取加入到分

PCR101LDNA

μ

,,

析仪专用深孔板中在各孔中分别加入的分子量内标和去离子甲酰胺置于离

0.1LLIZ-5008.9L

μμ

心机中。,,

1000g下离心10s将样品在PCR仪上95℃变性5min取出后迅速置于冰水中冷却

。。

10min以上离心10s后上机电泳

:。

注不同荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数通过预试验确定

9.4.2.2收集数据

,,。

启动DNA分析仪检查仪器工作状态后更换缓冲液灌胶将装有样品的深孔板置于样品架基座

,。,,

上打开数据收集软件将电泳板信息等录入后启动运行程序DNA分析仪自动收集毛细管电泳

数据。

10结果及判定

10.1结果记录

。

根据DNA分子量标准确定样品扩增谱带大小来表示每个SSR位点的等位变异以所分析的SSR

4

/—

LYT24262015

,,。

引物名称为前缀该标记在某样品上扩谱增带的分子量为后缀得到每个样品在某个标记的带型编号

示例1:

黄骅冬枣:,,/,,/,,。

BFU1205169171BFU0377298304BFU0614275275

示例2:

成武冬枣:,,/,,/,,。

BFU1205171181BFU0377298304BFU0614275275

10.2判定方法

,

对待检样品和对照品种以附录中的引物进行标记检测获得待检样品和对照品种在这些位点的

C

,,:

等位变异数据利用这些数据进行比较判定方法如下

),;

a检测样品间的差异谱带数≥2判定为不同的品种

),;

b检测样品间的差异谱带数=1判定为相近的品种

),。

c检测样品间的差异谱带数=0判定为疑同品种

)),//—。

对于或的情况按照和的规定进行田间鉴定

10.2b10.2cGBT19557.1LYT21902013

10.3结论

,