GB/T 18644-2020 猪囊尾蚴病诊断技术

ICS11.220

B41

圓

中华人民共和国国家标准

GB/T18644—2020

代替GB/T18644—2002

猪囊尾蚴病诊断技术

Diagnostictechniquesforporcinecysticercosis

2020-12-14发布2020-12-14实施

Illlilllll-

GB/T18644—2020

目次

前言Ill

弓IWIV

1范H1

2规范性引用文件1

3mm%1

4显微镜检查1

4.1i式齐1

4.2仪器设备1

4.3虫体采集2

4.4压片制备2

4.5显微镜检查2

4.6显微镜检查结果判定2

5PCR、法2

5.1i式齐lj2

5.2仪器设备2

5.3弓Itf3

5.4.3

5.5PCR操作程序3

5.6扩增产物电泳检测4

5.7试验成立条件4

5.8PCR结果判定4

6间接ELISA4

6.1i式齐lj4

6.2仪器设备4

6.3样品5

6.4试验步骤5

6.5试验成立条件6

6.6ELIS八结果判定6

7Dot-ABC-ELISA6

7.1i式齐IJ6

7.2仪器设备7

7.3#p°n7

7.4试验步骤7

7.5试验成立条件8

7.6Dot-ABC-ELIS八结果判定8

8综合判定8

GB/T18644—2020

附录八（规范性附录）生理盐水及猪囊尾蚴头节形态特征9

附录B(规范性附录）PCR引物位置、溶液配制及电泳结果10

附录C(规范性附录）ELISA试剂及其配制12

附录D(资料性附录）猪囊尾蚴TS-CC18重组蛋白的制备14

附录E(资料性附录）间接酶联免疫吸附试验的加样16

附录F(资料性附录）猪囊尾蚴TS-CC18和烯醇化酶单克隆抗体的制备17

附录G(资料性附录）Dot-ABC-ELIS八相关试剂配制及结果判定20

U

GB/T18644—2020

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准代替GB/T18644—2002《猪囊尾蚴病诊断技术》，与GB/T18644—2002相比，除编辑性修

改外，主要技术变化如下：

——范围部分增加了PCR和Dot-ABC-ELIS八技术（见第1章）；

——增加了缩略语部分(见第3章）；

——增加了病原的PCR检测方法（见第5章）；

——修改了酶联免疫吸附试验的检测抗原和检测步骤，直接对血清样品进行抗体检测（见第6章，

2002年版的第3章）；

——增加了检测循环抗原的Dot-ABC-ELIS八方法（见第7章）；

——增加了综合判定（见第8章）；

——增加了生理盐水及猪囊尾蚴头节图片（见附录A)，PCR引物位置、溶液配制及电泳图片（见附

录B)，ELISA试剂及其配制（见附录C，2002年版的附录八），猪囊尾蚴TS-CC18重组蛋白的

制备（见附录D)，间接酶联免疫吸附试验加样示例（见附录E)，猪囊尾蚴TS-CC18和烯醇化

酶单克隆抗体的制备（见附录F)，Dot-ABC-ELIS八相关试剂配制及结果判定（见附录G)。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。

本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。

本标准主要起草人：才学鹏、骆学农、张少华、郑亚东、郭爱疆、侯俊玲。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

——GB/TT18644—2002。

GB/T18644—2020

引

猪囊尾蝴病（porcinecysticercosis)是由猪带绦虫（Taeniaso/iww)的幼虫所引起的一种危害严重的

人兽共患寄生虫病。世界动物卫生组织将该病列为需申报的疾病之一。目前，该病广泛存在于发展中

国家，而且发达国家的病例也有逐年增加的趋势，不仅影响养猪业的发展，造成巨大的经济损失，而且还

严重威胁人类健康。

猪囊尾蚴病的诊断包括病原学诊断与血清学诊断。病原学诊断的目的在于确定临床剖检样本中虫

体的形态特征，在显微镜下观察头节顶突上有内外两圈排列整齐的小钩，即可判为猪囊尾蚴。若囊尾蚴

主要寄生于肝脏，则要注意与亚洲带绦虫囊尾蚴相区别。目前，该病的生前诊断主要采用血清学方法，

所用的抗原有虫体抗原、囊液抗原或分泌代谢抗原等，虽然这些抗原的检测敏感性较高，但特异性差，而

且抗原来源非常有限。鉴于以上原因，本次对GB/T18644—2002《猪囊尾蚴病诊断技术》的修订，除间

接EUS八所用抗原改为猪囊尾蚴期特异性18ku基因（TS-CC18)重组蛋白外，还增加了血清循环抗原

(CAg)检测方法和病原的PCR检测方法，以满足猪囊尾蚴病流行病学调查、药物治疗效果评价和动物

流通风险评估等不同需求。

本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到第6章间接酶联免疫吸附试验

(ELISA)相关的专利使用。

本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。

该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，

就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下

联系方式获得：

专利持有人姓名：才学鹏、张少华、景志忠、骆学农、郭爱疆、郑亚东、窦永喜。

地址：甘肃省兰州市盐场堡徐家坪1号。

请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专

利的责任。

GB/T18644—2020

猪囊尾蚴病诊断技术

1范围

本标准规定了猪囊尾蚴病的显微镜检查、聚合酶链式反应法（PCR法）、间接酶联免疫吸附试验（间

接ELISA)、斑点生物素-亲和素复合物酶联免疫吸附试验(Dot-ABC-ELISA)诊断技术及综合判定。

本标准适用于猪和野猪的囊尾蚴病诊断。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

CNAS-GL029:2018基因扩增领域检测实验室认可指南

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

八vidin-HRP:亲和素-辣根过氧化物酉$(八vidin-HorseradishPeroxidase)

D八B:二氣基联苯胺（3，S'-Diaminobenzidine)

Dot-ABC-ELISA:斑点生物素-亲和素复合物酶联免疫吸附试验CDot-Avidm-Biotin-Complex-

ELISA)

ELISA:酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)

HRP:辣根过氧化物酶（HorseRadishPeroxidase)

IPTG:异丙基爷1>硫代半乳糖苷（Isopropyl(3-I>Thiogalactoside)

NC:硝酸纤维素（Nicrocellulose)

OPD:邻苯二胺（O-phenylenediamine)

PBS:憐酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline)

PBST:洗漆液（PBScontaining0.5%Tween-20)

PCR:聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction)

TMB:四甲基联苯胺(3，3’，5，5'TTetramethylBenzidine)

4显微镜检查

4.1试剂

生理盐水配制见附录A中的八.1。

4.2仪器设备

4.2.1正置生物显微镜。

4,2.2手术剪、手术刀、镊子。

4.2.3载玻片。

1

GB/T18644—2020

4.2.4微量可调移液器（量程为20pL〜200pL)。

4.3虫体采集

肉眼观察舌肌、咬肌、内腰肌、膈肌、肩胛肌及心脏、肝脏、肺脏等组织，采集有可疑虫体寄生部位的

肌肉或内脏组织，用手术刀将其切成约1cm厚的薄片，仔细检查切口有无虫体。成熟的猪囊尾蚴为长

椭圆形，大小为（6mm〜10mm)X5mm，半透明，囊内充满液体，上有一粟粒大小的白色头节。脑内寄

生的则为圆球形，直径8mm〜10mm。以手术刀和镊子剥离肌肉等组织中的囊尾蚴，用生理盐水

洗净。

4.4压片制备

以手术剪剪开囊壁，取出完整的头节，以滤纸吸干囊液后，将其置于两张载玻片之间并压片。

4.5显微镜检查

将压片置于低倍显微镜(40X)下，仔细观察虫体头节的形态和特征。

4.6显微镜检查结果判定

如虫体头节的顶部有顶突，顶突上有内外两圈整齐排列的小钩，顶突的稍下方有四个均等的圆盘状

吸盘(见图八.1)，即判为猪囊尾蚴；如顶突无小钩则判为亚洲带绦虫囊尾蚴。猪囊尾蚴虫体应于

一20°〇或_70C°冰箱冻存。

5PCR法

5.1试剂

5.1.1PCR试剂

5.1.1.110XPCR缓冲液。

5.1.1.2dNTP预混液（2.5mmol/L)。

5.1.1.3Mg'Cl2(25mmol/L)。

5.1.1.4ExTaq酶（5U/pL)。

5.1.2电泳试剂

5.1.2.1电泳缓冲液：50XTAE贮存液（见附录B中的B.2.1)，临用时加蒸馏水配成1XTAE缓冲

液（见B.2.2)。

5.1.2.2琼脂糖:核酸电泳用琼脂糖。

5,1.2.3电泳加样缓冲液：见B.2.3。

5.1.2.4DNAMarker(DNA标志物）：条带大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp

和2000bp。

5.2仪器设备

5.2.1PCR扩增仪。

5.2.2台式低温高速离心机。

5.2.3稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。

5.2.4凝胶成像仪（或紫外透射仪）。

GB/T18644—2020

5.2.5微量可调移液器（量程为0.1pOL〜2.5p〇U〇.5pL〜10pL、10pL〜200pL、100pL〜1000mL)。

5.2,6无核酸酶的离心管与吸头。

5.2.7PCR扩增管。

5.3引物

5.3.1上游、下游引物序列

根据猪带绦虫线粒体ND1部分序列设计如下引物：

——上游引物:5'-CTAGGCCACTTAGTAGTTTT八GTTA-3’；

——下游引物:S'-CAT八八八八CACTC八八八CCTI7VTAGA-37。

PCR扩增片段的核苷酸序列及引物的位置见B.1。

5.3.2引物储存液

用去离子水将每条引物配成].〇〇的储存液，置于一20°C冻存。

5.3.3引物工作液

将上游、下游引物分别加去离子水配置为10ymol/L的引物工作液。

5.4样品

5.4.1猪囊尾蚴虫体的采集，方法同4.3。

5.4.2阳性对照：用猪囊尾蚴虫体提取的DNA。

5.4.3阴性对照：依据虫体采集部位，用未感染猪肌肉或肝脏提取的DNA。

5.5PCR操作程序

5.5.1DNA提取

用DN八提取试剂盒提取囊尾蚴和肌肉的基因组DNA。DN八提取应符合CNAS-GL029:2018基

因检测实验室区域的设置原则。

5.5.2PCR反应体系

采用50mL反应体系，扩增体系包括：

10XPCR反应缓冲液5fib

dNTP(2.5mmol/L)4/uL

MgCl2(25mmol/L)4/儿

上游引物工作液（10pmol/L)1/uL

下游引物工作液(10pmol/L)1

ExTaq酶（5U/mL)0.5pL

DN八模板100ng

去离子水补足至50juL

5.5.3扩增程序

将PCR扩增管放入扩增仪中，设定扩增程序：

——第一阶段，95C°预变性3min;

——第二阶段，95C°变性30s，45C°退火40s，72C°延伸60s，共进行35个循环；

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GB/T18644—2020

——第三阶段，72C°延伸5min。

5.6扩增产物电泳检测

5.6.11.2%琼脂糖凝胶的制备：称取1.2g琼脂糖，加人100mL1XTAE缓冲液（见B.2.1和B.2.2)

中。加热融化后加5pL质量浓度为10mg/mL的溴化乙锭，混匀后倒人放置于水平台面上的凝胶盘

中，胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔），

放人电泳槽中，加1XTAE缓冲液浸没胶面约3mm。

5.6,2加样：取10yLPCR扩增产物和2pL加样缓冲液（见B.2.3)混匀后加人一个加样孔。每次电泳

同时设标准DNAMarker、阴性对照和阳性对照。

5.6.3电泳检测：按5V/cm恒压电泳至溴酚蓝染料距离凝胶底部约1cm时，停止电泳，取出凝胶置于

凝胶成像仪下观察。

5.7试验成立条件

阳性对照样品有一条474bp扩增条带，阴性对照无条带或仅有引物二聚体条带（<100bp)，则试

验成立。

5.8PCR结果判定

待测样品有一条474bp的扩增条带，可判定该虫种为猪囊尾蚴（见图B.1)。

6间接ELISA

6.1试剂

6,1,1包被抗原：猪囊尾蚴TTS-CC18重组抗原。由构建的原核表达载体pET-28a(+)-TS-CC18转化

大肠杆菌BL2KDE3)，筛选高表达菌株进行诱导表达，采用Ni柱亲和层析纯化制备而成。使用时用碳

酸盐包被缓冲液（pH9.6)稀释至工作浓度。

6.1.2阴性对照血清:健康猪血清。采自3月龄非疫区健康猪，剖检确认无猪囊尾蚴感染；猪全血经自

然凝结法分离血清。检测时用样品稀释液稀释至工作浓度。

6.1.3阳性对照血清:猪高免血清。由TS-CC18纯化抗原免疫健康猪制备，检测时用样品稀释液稀释

至工作浓度。

6.1.4酶结合物：兔抗猪IgG-HRP结合物。检测时用样品稀释液稀释至工作浓度。

6儿5碳酸盐包被缓冲液:0.05mol/LNa2C03/NaHC03缓冲液（pH9.6)，见附录(：中的（：.1。

6.U洗涤缓冲液：含0.5%吐温-20的0.002mol/LPBS(pH7.2〜7.4)，见C.2。