GB/T 18648-2020 非洲猪瘟诊断技术

ICS11.220

B41GB

中华人民共和国国家标准

GB/T18648-2020

代替GB/T186482002

非洲猪瘟诊断技术

DiagnostictechniquesforAfricanswinefever

2020-12-14发布2020-12-14实施

国家市场监督管理总局申＃

国家标准化管理委员会保叩

GB/T18648-2020

目次

前育…..v

1范围………··………….1

2规范性引用文件……”…….1

3缩略语…………“………·……1

4生物安全措施…………“………·……1

5临床诊断………………”………·……1

5.1易感动物和宿主………”………·……1

5.2临床表现…………”………·……2

5.3病理变化…………”………·…….2

5.4临床诊断结果判定……………·…2

6实验室诊断样品采集及处理……·…………·……2

6.1试剂…”……··…………·………2

6.2采样用具……··…………·…H…a‘2

6.3样品采集……··……”……·………2

6.4样品处理………·……”………3

7普通PCR方法………·……”………3

7.1试剂”…………·……“…3

7.2仪器设备………·”·”…….3

7.3引物序列……4

7.4试验程序……………·………4

7.5试验成立条件…………”………·…….4

7.6普通PCR结果判定……”……….5

8荧光PCR方法…………”…5

8.1试剂…………”……·…5

8.2仪器设备……··……”……·…5

8.3引物和探针……·……”………·……5

8.4试验程序……·……”………·……5

8.5试验成立条件……..6

8.6荧光PCR结果判定……·……”…·……6

9荧光RAA方法……·……”…·……6

9.1试剂”·”………………”………….6

9.2仪器设备………”………….6

9.3引物”…………6

I

GB/T18648-2020

9.4试验程序………….6

9.5试验成立条件………….7

9.6荧光RAA结果判定………………7

10高敏荧光免疫分析法…………·……”……”7

10.l试弗u……·……”………7

10.2仪器设备…………·……”……”……..7

10.3试验程序……………·……”……”……..8

10.4高敏荧光免疫分析结果判定………………·……”……”……..8

11夹心ELISA抗原检测方法……··……””……..9

11.1试剂……·……””……..9

11.2仪器设备……·……”……”……..9

11.3试验程序……·……”……”……..9

11.4试验成立条件…·……”………·……10

11.5夹心ELISA抗原检测结果判定……”………·……10

12间接ELISA抗体检测方法………………”………·…10

12.1试剂………·……”…·…10

12.2仪器设备………….10

12.3试验程序……………….10

12.4试验成立条件……”……….11

12.5间接ELISA抗体检测结果判定………“….11

13阻断ELISA抗体检测方法……”·“….12

13.l试剂……·……”………·…12

13.2仪器设备……·……”………·…12

13.3试验程序…………”………·…12

13.4阻断率计算方法……·…………·……13

13.5试验成立条件…………·……”…·……13

13.6阻断ELISA抗体检测结果判定……·……”…·……13

14夹心ELISA抗体检测方法……13

14.1试剂…………··…..13

14.2仪器设备…………14

14.3试验程序………………“……….14

14.4试验成立条件……………15

14.5夹心ELISA抗体检测结果判定………15

15间接免疫荧光方法………………15

15.1试剂………··……15

15.2仪器设备……·…………·……16

15.3试验程序……·……”………·……16

Il

GB/T18648-2020

15.4试验成立条件……….16

15.5间接免疫荧光结果判定……………….17

16综合判定……………….17

附录AC规范性附录）样品保存液的配制方法……·……”……”…·……18

附录BC规范性附录）聚合酶链式反应溶液的配制方法…·……”…………19

附录cc规范性附录〉酶联免疫吸附试验溶液的配制方法……”…………20

m

GB/T18648-2020

前言

本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。

本标准代替GB/T18648-2002《非洲猪瘟诊断技术队与GB/T18648-2002相比，除编辑性修改

外，主要技术变化如下：

一一增加了缩略语（见第3章）;

一一增加了生物安全措施（见第4章）;

增加了临床诊断（见第5章）;

增加了实验室诊断样品采集及处理（见第6章）;

一一增加了荧光PCR方法（见第8章）、荧光RAA方法（见第9章〉、高敏荧光免疫分析法（见第10

章）、夹心ELISA抗原检测方法（见第11章〉、阻断ELISA抗体检测方法（见第13章）、夹心

ELISA抗体检测方法（见第14章）、间接免疫荧光方法（见第15章）等实验室诊断方法p

一一增加了综合判定（见第16章）;

增加了样品保存液的配制方法（见附录A）、聚合酶链式反应溶液的配制方法（见附录B);

修改了酶联免疫吸附试验溶液的配制方法（见附录C,2002年版的附录。。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。

本标准起草单位2中国动物卫生与流行病学中心。

本标准主要起草人g吴晓东、李林、胡永新、樊晓旭、邹艳丽、任炜杰、张永强、戈胜强、王清华、

李金明、包静月、赵永刚、徐天刚、李岭、刘珊、蒋正军、王树双、马洪超、王志亮。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为2

一－GB/T18648-20020

v

GB/T18648-2020

非洲猪瘟诊断技术

1范围

本标准规定了ASF的临床诊断，实验室诊断样品采集及处理，以及普通PCR方法、荧光PCR方

法、荧光RAA方法、高敏荧光免疫分析法、夹心ELISA抗原检测方法、间接ELISA抗体检测方法、阻

断ELISA抗体检测方法、夹心ELISA抗体检测方法、间接免疫荧光方法等实验室诊断方法。

本标准适用于家猪和野猪ASF的诊断与监测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单〉适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

3缩略语

下列缩略语适用于本文件．

ASF，非洲猪瘟（AfricanSwineFever)

ASFV，非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus)

DEPC，焦碳酸二乙醋（DiethyPyrocarbonate)

EDTA，乙二胶四乙酸（EthylenediaminetetraaceticAcid)

ELISA，酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)

FAM,6－竣基荧光素（6-Carboxy-Fluorescein)

OD，光密度（OpticalDensity)

PBS，磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline]

PCR，聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction)

RAA，重组酶介导的等温核酸扩增技术（RecombinaseAidedAmplification)

SPF，无特定病原体（SpecificPathogenFree]

TMB，四甲基联苯胶（3,3’，5,5’－Tetramethyl-Benzidine〕

4生物安全措施

进行ASF实验室诊断时，如样品处理、核酸提取等，应按照GB19489执行。

5临床诊断

5.1易感动物和宿主

猪科动物是ASFV的易感动物。家猪和欧亚野猪对ASFV高度易感，且表现出相似的临床症状和

死亡率s而非洲野猪，例如'/JC猪、丛林猪、红河猪和巨林猪，感染ASFV后很少或者不出现临床症状，是

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病毒的储存宿主。

5.2I临床表现

5.2.1最急性z无明显l临床症状突然死亡。

5.2.2急性s体温可高达42℃，沉郁，厌食，耳、四肢、腹部皮肤有出血点，可视都膜潮红、发钳。眼、鼻

有秸液版性分泌物s呕吐g便秘，粪便表面有血液和秸液覆盖F或腹泻，粪便带血。共济失调或步态僵直，

呼吸困难，病程延长则出现瘫痪、抽搞等其他神经症状。娃振母猪流产，病死率可达100%。病程

4d~10d0

5.2.3亚急性z临床症状与急性相同，但病情较轻，病死率较低．体温波动无规律，一般高于40.5℃．

仔猪病死率较高。病程5d~30do

5.2.4慢性g波状热，呼吸困难，湿咳。消瘦或发育迟缓，体弱，毛色暗淡。关节肿胀，皮肤溃庞，肢足。

死亡率低。病程2个月到15个月。

5.3病理变化

典型的病理变化包括浆膜表面充血、出血，肾脏、肺脏表面有出血点，心内膜和心外膜有大量出血

点，胃、肠道教膜弥漫性出血g胆囊、膨胀出血s肺脏肿大，切面流出泡沫性液体，气管内有血性泡沫样秸

液p脾脏肿大，易碎，呈暗红色至黑色，表面有出血点，边缘钝圆，有时出现边缘梗死s领下淋巴结、腹腔淋

巴结肿大，严重出血。最急性型的个体可能不出现明显的病理变化。

5.4I临床诊断结果判定

易感动物出现上述临床症状和病理变化，可初步判定为疑似ASF病例．

6实验室诊断样晶采集及处理

6.1试剂

6.1.10.1mol/LPBS(pH7.份，配制方法见附录A的A.lo

6.1.20.04mol/LPBS(pH7.4），配制方法”见A.2o

6.1.350%甘袖－PBS保存液，配制方法见A.30

6.1.4青霉素，浓度为10000IU/mLo

6.1.5链霉素，浓度为10000µg/mLo

6.2采样用具

6.2.1器械＝解剖刀、剪刀、银子、骨锯、注射器及针头、组织匀浆器等。

6.2.2容器z真空采血管（含EDTA抗凝剂）、离心管（2mL、10mL〕、样品保存管等。

6.2.3个人防护用具＝防护服、防护镜、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等。

6.2.4采样记录用品s采样单、记号笔、防水标签等四

6.2.5其他z医用棉签、医用纱布、封口膜、冰袋等。

6.3样晶采集

6.3.1口鼻拭子采集

采集病死猪或发病猪、同群猪的口鼻拭子样品。用医用棉签在口腔或鼻腔转动至少3圈，采集口

腔、鼻腔的分泌物g蘸取分泌物后，立即将拭子浸入1mL50%甘泊－PBS保存液中，剪去露出部分，盖紧

2

GB/T18648-2020

离心管莹，密封后冷藏或冷冻保存。

6.3.2全血样晶采集

在发病猪群中，使用真空采血管〈含EDTA抗凝剂〉采集一定数量发病猪、同群猪全血各5mL，密

封后冷藏或冷冻保存。

6.3.3血清样晶采集

在每一发病猪群中，采集发病猪、同群猪全血各5mL，室温放置12h~24h，分离血清，装人离心管

中，密封后冷藏或冷冻保存。

6.3.4组织样晶采集

采集病死猪或扑杀发病猪的组织样品。首选脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等。脾脏、肾

脏采集约3cm×3cm大小，扁桃体整体采集，淋巴结选取出血严重的整体采集，骨髓采集长度约3cm。

将所采集样品放入50%甘油－PBS保存液中。

6.4样晶处理

6.4.1口、鼻拭子样晶处理

口、鼻拭子标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。

6.4.2全血样晶处理

全血标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。

6.4.3血清样晶处理

血清标记样品编号，立即进行ASFV抗体检测或冷冻储存备用。

6.4.4组织样晶处理

取适量采集的组织样品置于组织匀浆器中充分研磨，加入终浓度为1000IU/mL的青霉素、

1000µg/mL的链霉素，灭菌的0.1mol/LPBS(pH7.4)ftl!j备10%组织匀浆液。2000r/min离心处理

10min，取上清液，标记编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。

7普通配R方法

7.1试剂

7.1.1DNA提取试剂盒。

7.1.2PCR预混液（2×）：TaqDNA聚合酶（0.05U/µL），反应缓冲液，4mmol/LMgCI，以及

0.4mmol/L的dNTP,

7.1.3元核酸酶水，配制方法见附录B的B.1,

7.1.4TAE缓冲液，配制方法见B.2和B.3,

7.1.52%的琼脂糖凝胶，配制方法见B.4。

7.1.66×上样缓冲液。

7.2仪器设备

7.2.1自动化核酸提取仪。

3

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7.2.2PCR扩增仪。

7.2.3台式低温高速离心机（最大离心力12000g以上）．

7.2.4稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。

7.2.5凝胶成像仪（或紫外透射仪）。

7.2.6微量可调移液器（2.5µL、10µL、100µL、200µL、1000µL等不同规格λ

7.2.7无核酸酶离心管与吸头。

7.2.8PCR扩增管。

7.3号l物序列

引物针对ASFVB646L基因的保守区域设计。上游引物PPA-1:5’-AGTTATGGGAAAC-

CCGACCC31；下游引物PPA2:51CCCTGAATCGGAGCATCCT31.扩增产物大小为257忡。

7.4试验程序

7.4.1核酸提取

采用DNA提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸，或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的病

毒核酸。如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，否则应置于一20℃冰箱保存，

每次拍提核酸，应至少包括一个阳性对照和一个阴性对照。阳性对照样品应为ASFV核酸阳性样

本（血清、全血、10%组织匀浆或细胞培养上清液）；阴性对照样品应为无核酸酶水或者ASFV核酸阴性

样本（血清、全血、10%组织匀浆或细胞培养上清液）。

7.4.2核酸扩增

7.4.2.1扩增体系

每个样品配制22µLPCR反应混合液，组成如下：