GB/T 19167-2020 传染性法氏囊病诊断技术

ICS11.220

B41GB

中华人民共和国国家标准

GB/T19167-2020

代替GB/T191672003

传染性法氏囊病诊断技术

Diagnostictechniquesforinfectiousbursaldisease

2020-12-14发布2020-12-14实施

国家市场监督管理总局告士

国家标准化管理委员会保W

GB/T19167-2020

前言

本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。

本标准代替GB/T19167-2003《传染性囊病诊断技术》，与GB/T19167-2003相比，除编辑性修

改外，主要技术变化如下z

一一将“传染性囊病”和“传染性法氏囊病”统一为“传染性法氏囊病’气

一一增加了规范性引用文件（见第2章）;

增加了缩略语〈见第3章h

增加了器材和试剂（见第5章、第6章、第7章、第8章、第9章）;

一一增加了临床诊断（见第4章）;

一一增加了实验室诊断样品采集（见第5章）；

一一删除了直接免疫荧光法（见2003年版的2.5.2);

一一删除了酶联免疫吸附试验（见2003年版的第5章）；

增加了RT-PCR检测方法〈见第7章、附录C、附录m;

增加了实时荧光RT-PCR检测方法（见第8章、附录b;

一一删除了血清抗体的检测（见2003年版的第4章）;

一一增加了细胞培养分离病毒检测方法（见9.4.1、附录的g

一一增加了诊断结果的综合判定（见第10章）。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。

本标准起草单位2中国动物卫生与流行病学中心、北京市农林科学院畜牧兽医研究所、中国农业科

学院啥尔滨兽医研究所。

本标准主要起草人z蒋文明、陈继明、刘月焕、玉笑梅、玉静静、刘爵、高玉龙、李阳、于晓慧、:XIJ朔、

庄青叶、李金平、侯广字、祁小乐、王素春、刘华雷，

本标准所代替标准的历次版本发布情况为＝

GB/T1916720030

I

GB/T19167-2020

引言

传染性法民囊病(Infectiousbursa!disease,IBD）又称甘布罗病（Gumborodisease），由双股RNA

病毒科（Birnaviridae）禽双股RNA病毒属（Avibirnavirus）传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起。火鸡、

鸭、珍珠鸡和驼鸟均可感染IBDV03周龄～6周龄的鸡发病急而且重，病死率高，而1周龄～3周龄鸡

常呈现亚急性或亚临床症状。该病毒侵害法氏囊可引起严重免疫抑制。已知IBDV有两个血清型，即

血清1型和2型，仅1型对鸡有致病性，火鸡和鸭为亚临床感染，2型未发现有致病性。

本病具有特征性临床症状和眼观病变，可做出初步诊断，确诊应进行病原检测。

2003年之后，国内外IBD诊断技术发展快速。一些更为简便和准确的诊断新技术已经成为IBD诊

断和预防的重耍手段。本次对IBD诊断技术的修订，目的有三＝一是与国际标准基本保持一致，改变国

家标准显著滞后于国际标准的状况g二是将一些在国内外经过多年实践证明成熟可行的新技术纳入进

来，改变原有标准中检测技术偏少且显著滞后于实际应用的状况。修订此标准，有利于我国IBD诊断

和预防，也有利于提升国家标准的权威性和实用性．

本标准参考OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册»（2016版），并结合我国相关技术研究新成果

进行修订。

Il

GB/T19167-2020

传染性法氏囊病诊断技术

1范围

本标准规定了传染性法民囊病临床诊断和实验室诊断的技术要求。

本标准适用于鸡传染性法民囊病的诊断、检测、监测和流行病学调查。其中琼脂凝胶免疫扩散试

验、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时荧光反转录聚合酶链式反应（实时荧光RT-PCR）、病毒分

离等诊断方法适用于临床疑似样本的检测与病毒分离，琼脂凝胶免疫扩散试验方法还适用于免疫抗体

水平检测，

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

3缩暗语

下列缩略语适用于本文件。

AGID：琼脂凝胶免疫扩散试验（Agargelimmunodiffusiontest)

CEF，鸡胚成纤维细胞（Chickembryofibroblastcell)

CPE，细胞病变（Cytopathiceffect)

IBO：传染性法氏囊病(Infectiousbursa!disease)

IBDV：传染性法民囊病病毒(Infectiousbursa!diseasevirus)

PBS，磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline)

PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction)

RT-PCR，反转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction)

Real-timeRT-PCR：实时荧光反转录聚合酶链式反应（Real-timereversetranscription-polymerase

chamreactmn)

SPF：元特定病原体（Specificpathogenfree)

TAE：三组甲基氨基甲烧乙酸乙二胶四乙酸（Trihydroxymethylaminomethaneaceticacid

ethylenediaminetetraaceticacid)

4l临床诊断

4.1流行病学

4.1.1自然感染仅发生于鸡，各种品种的鸡都能感染。

4.1.2主要发生于2周龄～15周龄的鸡，3周龄～6周龄的鸡最易感，而1周龄～3周龄鸡常呈现亚急

性或亚临床症状。

4.1.3常呈急性发病，传播迅速，通常在感染后第3天开始死亡，5d~7d达到高峰，后快速下降。

1

GB/T19167-2020

4.2临床症状

4.2.1潜伏期为2d~3d.

4.2.2易感鸡群感染后发病突然，病鸡体温突然升高，病鸡出现腹泻，排出白色秸稠或水样稀便，病程

一般为1周左右。

4.2.3急性病鸡可在出现症状1d~2d后死亡，鸡群3d~5d达死亡高峰，以后逐渐减少。

4.2.4随着病程的发展，食欲废绝，颈和全身震颤，病鸡步态不稳，羽毛蓬松，精神委顿，卧地不动，呼吸

困难，泄殖腔周围的羽毛被粪便污染．

4.2.5后期病鸡脱水严重，趾爪干燥，最后衰竭死亡。

4.3剖栓变化

4.3.1严重者腿部和胸部肌肉有条索状或斑块状出血。

4.3.2法民囊水肿和出血，体积增大，重量增加，严重者呈紫黑色、葡萄状g部分法氏囊出现萎缩。

4.3.3有些法民囊淡黄色水肿。

4.3.4肾肿大褪色，肾4、管有尿酸盐沉积，呈红自相间“花斑肾”

4.4结果判定

符合上述流行病学特征、临床症状和剖检变化的病例，可以判为疑似IBO，确诊应采集有1临床症状

动物的法氏囊等组织或血清进行实验室诊断，

5实验室诊断样晶采集

5.1器材

5.1.1手术剪刀和银子。

5.1.2离心管。

5.1.3样品保存管。

5.1.4组织匀浆器。

5.1.5采血器a

5.2试剂

5.2.10.01mol/LpH7.2PBS，配方见附录A中A.1。

5.2.2青霉素。

5.2.3链霉素。

5.3样晶采集

5.3.1生物安全措施

按照GB19489的要求进行。

5.3.2组织病料采集

采集多只病鸡的法氏囊，分别装人样品保存管，密封、冷冻保存。

5.3.3血清样晶采集

经翅静脉采集鸡血液，每只应不少于1mL，无菌分离血清，装入2mL离心管中，密封后2'C～8℃

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GB/T19167-2020

冷藏或20'C冷冻保存。

5.4样晶处理

用剪刀剪碎法氏囊组织，加入含青霉素4000IU/mL和链霉素4000µg/mL的PBS，用组织匀浆

器制成20%匀浆，反复冻融2次～3次，10000r/min离心10min，取上清作为检测材料。

6琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID)

6.1器材

6.1.137℃温箱。

6.1.2烧杯（200mL),

6.1.3搅拌棒。

6.1.4电磁炉。

6.1.5微量可调移液器(10µL、100µL、1000µL等不同规格〕。

6.1.6灭菌平皿（9cm~15cm）。

6.1.7打孔器（中心1孔，周围6孔，孔径3mm，孔距4mm）。

6.2试剂

6.2.1标准IBO琼扩阳性抗原（参见附录B的B.l)•

6.2.2标准IBO琼扩阴性抗原（参见B.2）。

6.2.3标准IBDV阳性血清（参见B.3）。

6.2.4标准IBDV阴性血清（参见B.4)•

6.2.5琼脂糖。

6.2.60.01mmol/L磷酸缓冲液（pH7.4），配方见A.2,

6.2.7氯化锅。

6.3试验程序

6.3.1琼脂平皿制备

参见B.5,

6.3.2打孔、封底

在制备好的琼脂板上用打孔器打孔，并挑出孔中的琼脂。中心l孔，周围6孔，孔径3mm，于L距

4mm，在火焰上封底。

6.3.3加样、孵育、观察

6.3.3.1病原检测

中央孔加入标准IBDV阳性血清，第1孔、第4孔分别加入标准IBO琼扩阳性抗原和标准IBO琼

扩阴性抗原，其他孔分别加入待检样品，20µL／孔。静置5min~10min，将加样后的平皿轻轻倒置放

人填有湿纱布的盒内，置于37℃温箱，在24h、48h观察并记录结果。

6.3.3.2抗体检测

中央孔加入标准IBO琼扩阳性抗原，第1孔、第4孔分别加入标准IBDV阳性血清和标准IBDV阴

性血清，其他孔分别加入待检样品s或第1孔加入标准IBO阳性血清，其他孔分别加入倍比稀释的待检

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GB/T19167-2020

血清，20µL／孔。静置5min~10min，将加样后的平皿轻轻倒置放人填有湿纱布的盒内，置于37℃温

箱，在24h、48h观察并记录结果。

6.4试验成立条件

24h，标准IBDV阳性血清与标准IBD琼扩阳性抗原孔之间形成清晰沉淀线，标准IBDV阳性血清

与标准IBD琼扩阴性抗原孔之间未形成清晰沉淀线。

6.5结果判定

6.5.1病原检测

24h或48h，待检样品孔与标准IBDV阳性血清孔之间出现沉淀线，且与标准IBD琼扩阳性抗原

沉淀线末端相吻合时，待检样品判为阳性g标准IBD琼扩阴性抗原孔和待检样品孔与标准IBDV阳性

血清孔之间无沉淀线出现时，待检样品判为阴性（参见图B.l)。

6.5.2抗体检测

待检血清孔与标准IBD琼扩阳性抗原孔之间出现沉淀线，且与标准IBDV阳性血清沉淀线未端相

吻合时，待检血清判为阳性s待检血清孔与标准IBD琼扩阳性抗原孔之间无沉淀线出现时，待检血清判

为阴性（参见图B.2）。

标准IBD