GB/T 24310-2009 烟草及烟草制品 转基因检测方法

ICS

65．160

X85

圆雪

中华人民共和国国家标准

24310—2009

GB／T

烟草及烟草制品转基因检测方法

Tobacco

andtobacco

products--

methodofmodifiedcontents

Detectinggeneticallyorganism

2009-09-30发布

丰瞀髁鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会促111

24310—2009

GB／T

目次

前言…………………………l

l范围………………’……‘‘l

2规范性引用文件………………’………………’’’’……‘1

3术语和定义……………………’’………………’’……‘‘l

4实验室要求………………z

5试剂………………’………………’……’3

6仪器设备……………………’’………………’…………3

7取样……··……·………··………‘………’’…‘…………4

8烟叶样品DNA提取方法…………···………………’’’…………’…。。4

9转基因烟草定性检测方法………’’’………………’’………………’’’’5

10转基因烟草定量检测……………····………………’……………’…’“7

11转基因烟草检测验证标准……………’’…………’’’…。8

12检测报告……···………………··………………’’’’’………………’…………………。9

附录A(规范性附录)含EB电泳液的处理方法………………’’’………………’’………………’’’。10

附录B(规范性附录)各类样品的DNA提取方法…………’’’’……………’’’……‘‘11

附录C(规范性附录)DNA提取物的浓度和纯度的测定方法………’’’………………’’’…………12

附录D(规范性附录)烟草转基因检测PCR扩增体系与扩增条件…………………13

附录E(规范性附录)溶液的配制…·…·………………’………………’’……………。14

附录F(规范性附录)荧光定量PCR扩增体系与扩增条件…………16

附录G(资料性附录)烟草转基因检测结果报告单……………………18

GB／T

24310一2009

前言

本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录，附录G为资料性附录。

本标准由国家烟草专卖局提出。

本标准由全国烟草标准化技术委员会(SAC／TC144)归口。

本标准起草单位：中国烟草进出口烟叶检测站、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：郭兆奎、陈枝南、冯茜、万秀清、颜培强、李丽杰、乔婵、孙宏宇。

24310—2009

GB／T

烟草及烟草制品转基因检测方法

1范围

本标准规定了烟草种子、鲜烟叶、初烤烟、片烟和卷烟烟丝进行转基因成分检测的样品取样方法和

实验室检测方法。

本标准适用于烟草及烟草制品转基因成分检测。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有

的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB／T

5606．1卷烟第1部分：抽样

GB／T

19616烟草成批原料取样的一般原则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3．1

modified

tobacco

转基因烟草genetically

通过基因工程技术或现代生物技术改变基因组构成的烟草。

3．2

小样increment

在一个取样单位一次取出的一定数量的烟草，构成单样的一部分。

19616

[GB／T2004，定义2．6]

3．3

样品sample

从一个群体中选取的一个或多个具有代表性的样本单位。

3．4

实验室样品laboratorysample

用于实验室检验或测试的样品，其代表总样。

19616

[GB／T2004，定义2．10]

3．5

检测样品test

sample

实验室样品经过研磨和匀浆(如果需要)处理后进行分析测定的样品。

3．6

chainreaction

聚合酶链式反应扩增polymeraseamplification

PCR扩增

通过多次的高温变性、退火和延伸的循环过程，最终使目标DNA片段以几何倍数扩增。

】

24310—2009

GB／T

3．7

nestedPCR

巢式PCR

PCR扩增过程中，首先用一对外引物进行第一轮PCR，然后以第一轮PCR扩增产物为模板，使用

第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增。

3．8

sembn∞tedPCR

半巢式PCR

为模板，使用该模板DNA序列内部的一个引物及第一轮扩增中的一条外引物进行第二次PCR扩增。

3．9

PCR

实时定量PCR扩增real—timeamplification

在PCR反应体系中加入荧光探针或荧光染料，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通

过标准曲线对未知模板进行定量分析。

3．10

看家基因housekeepinggene

细胞或生物体整个生命过程中都持续需要而且必不可少的组成型表达基因。

3．11

control

阳性对照样品positivesample

经鉴定为含有检测目标成分的对照烟草样品。

3．12

control

sample

阴性对照样品negative

经鉴定为不含有检测目标成分的对照烟草样品。

3．13

control

试剂对照样品reagentsample

检测过程中与样品一起进行各种检测操作的试剂参照样品。

3。14

blankcontrol

提取空白对照样品extractionsample

样品DNA提取过程中放置在操作区内的开盖的空白参照样品。

3．15

特异性specificity

特异地检测某种物质，并可将其与相似物质、杂质或降解物分辨开来的能力。

4实验室要求

4．1样品重复检测

每个待测样品随机分成两份，每份单独进行DNA提取和PCR分析。

4．2对照样品

每次试验中均设置阳性对照、阴性对照、试剂对照及提取空白对照。在定性检测时选用0．1％阳性

oA阳性对照建立标准曲线。

作为阳性对照；定量检测时设置0．1％、0．5％、1．o％、2．o％、5．o

4．3防止污染

样品准备、样品前处理、DNA提取、PCR反应液加样、PCR扩增和电泳与凝胶观察等操作在相互隔

离并具有100％外排风的不同操作间中进行，并设置紫外灯，操作前后进行空间过夜照射。样品研磨在

强力通风橱中进行，每个样品更换一次塑料手套；样品的称量应设专用天平，不可在称量试剂的天平室

内进行；用于提取DNA和PCR扩增的耗材、用具使用前都应进行灭菌处理，tip头和各种离心管一次性

使用。

2

24310—2009

GB／T

4．4安全防护

整个试验操作过程中必须穿着工作服和佩戴手套，特别在接触EB时应带抗化学腐蚀的手套及

口罩。

4．5有毒废弃物处理

4．5．1含EB的电泳液

处理方法见附录A。

4．5．2含EB的凝胶

含有EB的废凝胶暂存于广口瓶中，定期放人生物危害焚烧炉中进行焚烧处理。

5试剂

除非特别说明，检测中仅使用分析纯化学试剂和超纯去离子水，PCR反应体系用水应使用电阻率

为18．2

Mn·cm以上的超纯水。各种缓冲液均冷藏于4℃冰箱，各种酶和抗生素母液冻存于一20℃

以下冰箱。

5．1十二烷基硫酸钠(sDs)。

5．2乙二胺四乙酸钠(EDTA)。

5．3十六烷基-Z．甲基一乙基一溴化铵(CTAB)。

5．4Tris碱。

5．5Tris-HCl。

5．6聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

5．7液氮。

5．8三氯甲烷。

5．9异戊醇。

5．102一巯基乙醇。

5．11乙醇。

5．12硼酸。

5．13氢氧化钠。

5．14琼脂糖。

5．15溴酚蓝。

5．16二甲苯青FF。

5．17溴乙锭。

5．18冰醋酸。

5．19溴乙锭(EB)。

5．20NaCl。

5．21MgCl2。

5．22DNA聚合酶。

5．2310XPCR缓冲液。

5．24尿嘧啶DNA糖基酶(uNG酶)。

5．255

dNTPs液(dATP、dCTP、dGTP各2．5mmol／L，dUTPmmol／L)。

5．26DNA标准分子量。

5．27限制性内切酶(Xmnl、EcoRV、NsiI)。

5．28SYBRGteen

I染料。

6仪器设备

6．1PCR仪(控温精度士0．3℃)。

3

GB／T24310一2009

6．2紫外分光光度计(波长精度0．3nm)。

6．3荧光定量PCR仪(控温精度士0．4℃)。

V～600

6．4电泳系统(50V，10mA～400mA)。

DNA>／o．05

6．5紫外分析仪(检测灵敏度：Protein≥o．02ngng)。

6．6恒温水浴锅(精度土0．1℃)。

6．7高速冷冻离心机(最大离心力30

0009)。

6．8微量离心机(最大离心力200009)。

6．9mA)。

pH计(精度±0．02pH或士2

1

6．10分析天平(感量0．000g)。

6．11超低温冰箱(一40℃～一86℃)。

6．12微量移液器(10

pL、20pL、50pL、100pL、200ItL、1000弘L，精度≤o．8％～1．0％)。

6．13超纯水器(电阻率18．2Mn·cm)。

000

6．14磁力搅拌器(转速0～2r／rain)。

6．15超净工作台[截流效率：99．9999％，层流风速：0．45m／s(90fpm)]。

6．16恒温干燥箱(30℃～300℃，温度波动士1％，控温精度士1％)。

7取样

7．1种子

以品种和种子产地为取样单位，即每个品种作为一个样品，对虽为同一品种，但供种单位(种子产地

来源)不同，也作为单一样品取样，每一样品随机多点取样10g，样品编号注明品种名称、种子产地。

7．2鲜烟叶

鲜烟叶样品在田间取样，以品种和种子产地为取样单位随机取样，每个样品在10个不同地块各取

一个嫩芽或叶片，编号注明品种名称、种子来源、取样地点、取样单位、取样人、日期等信息，自然失水2d

后放人塑料袋中。

7．3初烤烟

以检验批为单位，每检验批的产地和等级应是相同的，50件以下随机选2件各取1个小样，5l件～

50件按50件计)增取1个小样，各小样混合后用四分法缩分出均匀样品2份(每份250g)作实验室样

品供检验和复检，实验室样品应密封并填写标签，注明产地、等级报验号、送样单位、取样人。

7．4片烟

对于已装箱的片烟，以箱(内装100kg烟叶)为取样单位，用长筒状取样器，每箱随机取约2g烟

叶，将每个集装箱的99箱烟叶所取的近200

g烟叶作为一个检测样品；也可在复烤加工车间，结合水分

测定取样，注明烟叶产地、等级和箱号、取样地点、送样单位和取样人。

7．5卷烟

按照GB／T5606．1中规定的方法进行卷烟抽样。

8烟叶样品DNA提取方法

8．1样品前处理

8．1．1种子

随机取烟草种子样品放人装有滤纸保湿的培养皿中，28℃光照下培养7d，用滤纸吸出表面水分，

称种子萌发幼苗质量约900mL

mg，在灭菌的研钵内加液氮研磨呈粉末，分别装入3个已知质量的15

离心管中，再称量，置--20℃冰箱中储存备用。

4