DB35/T 1513-2015 柑橘属果实中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的测定 高效液相色谱法

ICS11.120.10

C15

DB35

福建省地方标准

DB35/T1513—2015

柑橘属果实中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的

测定高效液相色谱法

DeterminationofContentofNarigin,Hesperidinand

NeohesperidinincitrusfruitsbyHPLC

2015-06-26发布2015-09-26实施

福建省质量技术监督局发布

DB35/T1513—2015

前言

本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。

本标准由福建省农业科学院提出。

本标准由福建省农业厅归口。

本标准起草单位：福建省农科院中心实验室

本标准主要起草人：潘葳、刘文静、罗钦。

I

DB35/T1513—2015

柑橘属果实中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的测定高效液相色谱法

1范围

本标准规定了芸香科柑橘属植物果实中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的高效液相色谱测定方法。

本标准适用于橘、柑、柚、橙、柠檬、香橼或称枸橼（佛手）等芸香科柑橘属植物果实中柚皮苷、

橙皮苷和新橙皮苷的测定。

本标准方法测定柑橘属植物鲜基中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的定量限均为0.05µg/g，检出限

均为0.016µg/g；柑橘属植物干基中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的定量限均为2.5µg/g，检出限均为

0.76µg/g。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法。

3原理

试样中的柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷用甲醇提取，提取液离心后，取上清液，经微孔滤膜过滤，高

效液相色谱-紫外检测法测定，外标法定量。

4试剂和材料

除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682-2008中一级水的要求。

4.1甲醇（CH4O）：色谱纯。

4.2乙腈（C2H3N）：色谱纯。

4.3冰醋酸（C2H4O2）。

4.4柚皮苷标准品（CAS520-26-3）：纯度≥97%（质量分数）。

4.5橙皮苷标准品（CAS10236-47-2）：纯度≥98%（质量分数）。

4.6新橙皮苷标准品（CAS13241-33-3）：纯度≥98%（质量分数）。

4.7甲醇（CH4O）。

4.80.5%乙酸溶液：移取5.0mL冰醋酸（4.3），用水稀释并定容至1000mL。

4.9流动相：将20体积乙腈（4.2）与80体积0.5%乙酸溶液（4.8）混合。使用前经微孔滤膜（5.9）

过滤并脱气。

4.10柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷混合标准贮备液（1.0mg/mL）：准确称取柚皮苷（4.4）、橙皮苷（4.5）

和新橙皮苷（4.6）标准品各10mg（精确至0.1mg），于10mL容量瓶中，用甲醇（4.1）溶解并稀释

至刻度，配制成浓度为1.0mg/mL的柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷混合标准贮备液。2℃～8℃保存，有

效期2个月。

1

DB35/T1513—2015

4.11柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷混合标准工作液：分别准确移取0.05mL、0.5mL、5.0mL、10.0mL、

25.0mL柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷混合标准贮备液（4.10）于不同的50mL容量瓶中，用流动相溶液

（4.9）稀释并定容至刻度，摇匀，得到不同浓度的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷混合标准工作溶液（质

量浓度分别为1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL），即配即用。

5仪器和设备

5.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。

5.2电子天平：感量0.1mg。

5.3鼓风干燥箱：温度可控。

5.4高速万能粉碎机：转速24000r/min，或相当的设备。

5.5组织捣碎机：转速12000r/min，或相当的设备。

5.6超声波清洗器：超声波频率40kHz，或相当的设备。

5.7离心机型号1：体积50mL，转速不低于4000r/min或相当的设备。

5.8离心机型号2：体积2mL，转速不低于10000r/min或相当的设备。

5.9微孔滤膜：0.22μm，直径25mm的聚砜膜或相当者。

5.10离心管：1mL（具塞）。

5.11分样筛：筛网孔径为425μm。

6分析步骤

6.1样品前处理

6.1.1鲜基样品

取一份柑橘属植物果实样品，将柑橘属果实分成果皮、果瓤两部分，分别将果皮切碎、果瓤掰碎，

称取有代表性的样品100.0g，放入组织捣碎机（5.5）中，加入100mL甲醇（4.7），匀浆，用离心机

（5.7）4000r/min离心10min，将上清液转移到250mL容量瓶，残渣加入50mL甲醇（4.7），用超

声波清洗器（5.6）于35℃超声波萃取15min，用离心机（5.7）4000r/min离心10min，合并上清液

于250mL容量瓶中。再用50mL甲醇（4.7）重复以上萃取和离心步骤，合并上清液于250mL容量瓶

中，用甲醇（4.7）定容至刻度，摇匀。取一定量的提取液，用离心机（5.8）以10000r/min高速离心

10min，分离沉淀蛋白质、果胶等干扰物质，取上清液用微孔滤膜（5.9）过滤，滤液供上机分析（72h

完成测定）。

6.1.2干基样品

将柑橘属果实分成果皮、果瓤两部分，分别将果皮切碎、果瓤掰散，在60℃±2℃下干燥至恒重，

冷却至室温，粉碎，过分样筛（5.11），制备的样品粉末保存于干燥器内备用。称取约0.1g（精确到

0.1mg）样品于25mL容量瓶中，加20mL甲醇（4.7），于35℃超声加热提取30min，冷却至室温，

定容，取一定量的提取液，用离心机（5.8）以10000r/min高速离心10min，取上清液用微孔滤膜（5.9）

过滤，滤液供上机分析（72h完成测定）。

6.2样品测定

6.2.1高效液相色谱参考条件

2

DB35/T1513—2015

以下分析条件可供参考，采用其它条件应验证其适用性：

——色谱柱：C18柱，长150mm，内径4.6mm，粒径3μm，或性能相当者。

——柱温：40℃；

——紫外检测波长：283nm；

——流速：1.0mL/min；

——进样体积：10μL。

6.2.2液相色谱测定

分别取适量的柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷标准工作溶液（4.12）及待测样液，按6.2.1列出的条件

进行液相色谱分析测定。由保留时间进行定性，外标法定量，根据标准工作溶液的浓度及柚皮苷、橙皮

苷和新橙皮苷响应峰面积，建立标准工作曲线。工作曲线线性相关系数R2≥0.99。

待测样液中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的响应值应在标准曲线范围内，超过线性范围则应稀释后再

进行分析。分析间每20次样品测定后应加入一个与样品峰面积相近的标准工作液，如果测得的值与原

值相对平均偏差超过5%，则应重新进行标准曲线的制作。标准样品及典型样品色谱图参见附录A。

7结果计算与表示

7.1结果计算

柑橘属植物果实中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量按式（1）进行计算：

cVf3

X10................................(1)

m

式中：

X——试样中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量（以质量分数计），单位为毫克每克（mg/g）；

c——由标准工作曲线得出的柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V——试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；

f——试样稀释倍数；

m——试样质量，单位为克（g）。

7.2结果表示

测定结果以平行测定的算术平均值表示，计算结果保留两位有效数字。在重复条件下获得的两次独

立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

8精密度和回收率

本方法的精密度和回收率试验结果参见附录B。

9检验报告

检验报告应包括以下内容：

——识别被测试样需要的所有信息；

——依据本标准方法；

3

DB35/T1513—2015

——柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的测定结果；

——实验日期；

——测定人员。

此外，还需说明使用的方法，还应包括本标准未规定的或选择性的条件，以及可能影响结果的其它

条件。测试报告应包括试样的唯一性资料。

4

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AA

附录A

（资料性附录）

色谱图示例

标准溶液及典型样品色谱图示例分别见图A.1～图A.15。

0.008

-8.988-

-10.219

0.00612.328-

柚皮苷

橙皮苷

0.004

AU

新橙皮苷

0.002

0.000

-0.002

1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.00

min

图A.1标准溶液色谱图

0.12

0.10

-8.899-

0.08

柚皮苷

AU0.06

-12.185-

0.04-10.077

0.02

新橙皮苷

橙皮苷

0.00

1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0