T/CRHA 052-2024 基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价技术

ICS11.100

CCSC04

团体标准

T/CRHA052—2024

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基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价

技术

Evaluationofdrug-inducedhepatotoxicitybasedonhumanliverorganoids

2024-05-15发布2024-05-20实施

中国研究型医院学会发布

T/CRHA052—2024

目次

前言.........................................................................Ⅱ

引言........................................................................Ⅲ

1范围.......................................................................1

2规范性引用文件.............................................................1

3术语和定义.................................................................1

4缩略语.....................................................................2

5一般规定...................................................................2

6评价内容及流程.............................................................5

7评价报告及结果解释........................................................10

附录A（资料性）S药物的肝脏毒性评价实验方案.................................12

附录B（资料性）S药物的肝脏毒性评价报告.....................................16

参考文献....................................................................19

I

T/CRHA052—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规

则》给出的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责

任。

本文件由中国研究型医院学会肝胆胰外科专业委员会提出。

本文件由中国研究型医院学会归口。

本文件起草单位：清华大学附属北京清华长庚医院、中国食品药品检定研究院、中国

计量科学研究院、中国医学科学院药物研究所、中国科学院上海药物研究所、南方医科大

学、上海美迪西生物医药股份有限公司。

本文件主要起草人：王韫芳、柳娟、阴雯臻、李迪、耿兴超、王晶、傅博强、强桂芬、

潘国宇、彭双清、李桦、毕惠嫦。

II

T/CRHA052—2024

引言

药物不良反应是一个重要的临床问题，也是卫生系统的主要经济负担和制药行业面临

的巨大挑战。药源性肝损伤（drug—inducedliverinjury，DILI）是临床上最常见的药

物不良反应之一，也是当前急性肝损伤最为常见的病因之一，严重者可导致急性肝衰竭、

甚至死亡。

目前的临床前药物试验程序难以有效的预测患者是否发生DILI，评价模型和技术的缺

乏是造成药物研发失败率高的主要原因。采用合理、有效的模型预测药物-药物相互作用及

潜在DILI是制药领域面临的严峻科学挑战。传统二维培养的肝细胞（系）模型过于简单、

不具备生理特性而无法再现药物体内发生的相对复杂的代谢与毒性事件，而人源肝脏类器

官作为药物代谢及药物毒性预测的模型，能够更真实地反映候选药物对人体的影响，同时

可以减少动物研究所致的偏差。

近期，美国食品药品监督管理局发布了减少药物临床试验前的动物试验，而鼓励微组

织与器官芯片列为替代模型的指导原则。实际上，人源肝脏类器官模型已有许多公司和机

构用于药物筛选及评价，但其发展仍存在一些技术规范障碍。本文件的制定有助于推动基

于人源肝脏类器官的药物肝脏安全性评价的标准化建设，助力行业规范发展。

III

T/CRHA052—2024

基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价技术

【警示】使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。

使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本文件给出了基于人源肝脏类器官开展药物体外肝脏毒性评价的一般规定、评价内容及流程、评

价报告及结果解释要求。

本文件适用于医药企业、科研机构等试验人员开展基于人源肝脏类器官肝细胞脂肪变和胆汁淤积

相关的药物肝脏毒性评价。

本文件的试验方法适用于96孔板。其它孔数的多孔板可参考本文件。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适

用于本文件。

GB/T16886.5—2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验（ISO10993-5:2009）

T/CSCB0008—2021原代人肝细胞

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

人源肝脏类器官humanliverorganoid

通过多能干细胞、组织前体细胞或者成体细胞，依靠细胞自组装能力构建的三维细胞结构，它具

备类似于人类肝脏的生理结构和功能，并能提供更准确和可靠的体外实验模型。

注：人源肝脏类器官可被用于评估药物对人肝脏的毒性影响，可以更好地预测药物的代谢途径、

药效和毒性反应。

3.2

药源性肝损伤drug-inducedliverinjury；DILI

由药物及其代谢物引起的肝细胞损伤和/或坏死，进而导致肝酶升高、黄疸、肝功能衰竭等肝功能

异常表现。

3.3

肝脏毒性评价hepatotoxicityevaluation

用来评估某种物质或药物对肝脏功能的潜在危害程度的过程。这种评价可以通过多种方法进行，

包括体外实验、动物模型和临床观察。

3.4

剂量反应关系dose-responserelationship

药物暴露剂量与生物效应之间的关系，通常使用剂量反应曲线来描述。

1

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3.5

对照组controlgroup

在进行肝脏毒理学评价时，为便于与实验组进行比较而设立的一组参照物质或实验样本。它是一

种不含受试物的介质，在进行受试物处理时放置于与试验样品相同的器皿中，并在与试验样品相同的

条件下进行处理。

3.6

实验样本experimentalsample

在肝脏毒理学评价中用于进行分析、观察和验证的被测试物质或物体的代表性样品。

3.7

溶剂空白solventblank

为检测实验中可能产生的背景噪音或误差而设置的，不含待测物或对照品的介质，用以确保实验

结果的准确性和可靠性。

[来源：GB/T16886.5—2017，3.3，有修改]

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

ALB——白蛋白（Albumin）

ALT——谷丙转氨酶（Alaninetransaminase）

AOP——有害结局路径（Adverseoutcomepathway）

AST——谷草转氨酶（Aspartatetransaminase）

CMFDA——5-氯甲基荧光素醋酸酯（5-chloromethylfluoresceindiacetate）

CYPs——细胞色素酶P450（CytochromeP450enzymesystem）

DMOS——二甲基亚砜（DimethylSulfoxide）

FBS——胎牛血清(Fetalbovineserum)

GSH——谷胱甘肽（Glutathione）

HCS——高内涵筛选（Highcontentscreening）

MMP——线粒体膜电位（Mitochondrialmembranepotential）

P/S——青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin）

ROS——活性氧（Reactiveoxygenspecies）

5一般规定

5.1试剂

试剂选择如下：

a）细胞活力检测试剂应使用细胞活力检测试剂盒；

b）生化指标检测试剂应使用谷丙转氨酶(ALT/GPT)试剂盒和谷草转氨酶(AST/GOT)试剂盒；

c）生化指标检测试剂宜根据肝脏损伤的毒性结局类型，优先推荐检测细胞活率、细胞凋亡、脂肪

性病变和胆汁淤积4个肝毒性评价指标，主要检测指标及对应检测试剂见下表1。

2

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表1HCS试验中荧光探针选择

激发波长发射波长

检测指标荧光探针/

Excitationwavelength/

DetectionindicatorFluorescentprobe

emissionwavelength

细胞活率CalceinAM495/515nm(green)

EthD-1495/635nm(red)

细胞凋亡Caspase-3/7502/530nm(green)

脂滴面积与微组织面积的比值；

脂滴总荧光强度与微组织面积的比值NileRed543/598nm(red)

形成的微胆管面积与微组织面积的比值；

微胆管平均荧光强度CMFDA492/517nm(green)

注：通常选用几个终点组合以获得最准确的DILI检测结果，针对不同的检测指标选用不同的荧光染

料，在同时检测多个肝毒性评价指标时，要求每种荧光染料的激发波长和发射波长不重叠。

5.2材料和培养器皿

5.2.1人源肝脏类器官的细胞

人源肝脏类器官的细胞应选用来源于肝细胞系（包括但不限于Huh7，HepG2-C3A，LO2，

HepaRG）、原代肝细胞、原代肝细胞衍生的肝细胞、干细胞分化来源的肝细胞等新型肝细胞体系,包

括但不限于:

——胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化来源的肝细胞;

——直接转分化肝细胞;

——退分化形成的肝细胞ProliHH。

5.2.2待测药物

待测药物的准备应按《人用药品注册技术要求国际协调会ICH三方协调指导原则》，其工作时的

最高浓度设置应符合以下要求：

——不受溶媒或培养液中的溶解度限制时，最高浓度是1mM或0.5mg/ml（选择其中较低者）；

——受到溶解度限制时，最高浓度应采用培养液中产生最少可见沉淀的最低浓度（若其不干扰评

分）。通过肉眼或光镜检查等方法对沉淀进行评价，来说明在培养过程中沉淀持续存在或出现（至给

药结束）。

5.2.3培养细胞所需溶液

应选取适当配方的、含有必需营养物和辅助因子的细胞培养基，用于支持人源肝脏类器官的生长

和维持，包括：

——0.05%胰蛋白酶-EDTA用于人源肝脏类器官的释放和分离。

——磷酸缓冲液（PBS）用于洗涤和处理人源肝脏类器官样本。

——蒸馏水（或任何适合细胞培养的纯化水）用于制备培养基、溶液和洗涤人源肝脏类器官。

5.2.4培养器皿

应选用适用于细胞培养的器皿，包括但不限于：

——玻璃培养皿

——塑料培养瓶或塑料多孔培养板

——微量滴定板

——96孔组织细胞培养级孔板。

注：只要符合组织培养的要求，并可以用于动物细胞的培养，其他孔板（如384孔板、24孔板和6

孔板）也可以替代使用。

5.3仪器

5.3.1培养箱

稳定的温度（37℃）、稳定的CO2水平（5%）、较高的相对饱和湿度（95%）。

3

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5.3.2多功能酶标仪

适用于96孔板培养器皿、波长范围：400-1000nm、带有发光检测模块。

5.3.3高内涵细胞定量成像分析系统或荧光显微镜

高内涵细胞定量成像分析系统或荧光显微镜应符合以下要求：

——高内涵细胞定量成像分析系统，包括全自动高速显微成像、全自动图像分析和数据管理。

——荧光显微镜，包括光源、滤板系统和光学系统。

——系统和显微镜的激发波长范围为355-675nm，发射波长范围为430-760nm。

5.3.4离心机

应符合以下要求：

——加速度大于等于2000rcf；

——离心力1,000~10,000rcf。

5.3.5超净工作台或生物安全柜

应提供高效的环境净化，包括无菌空气过滤、消毒和防护机制，以确保细胞培养过程中的无菌操

作和确保细胞及操作者的生物安全。

5.3.6倒置相差显微镜

应具有高分辨率和高清晰度（10倍、20倍、40倍或60倍物镜），能够显示微小组织结构和细胞；

配备有高质量物镜和目镜。

5.3.7实验室天平

应使用电子式天平，量程为0.1mg~200g，分度值不大于1mg。

5.3.8电子细胞计数仪或血细胞计数器

应能够快速、精准地计数细胞数量，并具备高度重复性和准确性。

5.4准备工作

5.4.1评价方案准备

开展药物肝脏毒性评价前应制定评价实验方案，方案内容及格式参见附录A。

5.4.2测试用试剂准备

5.4.2.1CTG试剂盒应按以下步骤准备：

1)将试剂盒放置在4℃过夜，使试剂缓慢解冻；

2)在使用前将试剂置于22℃水浴中约30min，将其温度平衡至室温；

3)颠倒内容物轻轻混匀，以获得均质溶液。

5.4.2.2ALT和AST试剂应按以下步骤准备：

1)使用前将试剂置于37℃水浴中预热约30min；

2)颠倒内容物轻轻混匀，以获得均质溶液。

5.4.3CalceinAM/EthD-1试剂应按以下步骤准备：

1)-20℃避光保存，

2)使用前用预热好的无血清细胞培养基或PBS稀释储存液配制2µMCalceinAM和4µMEthD-I

的染色工作液。

5.4.4Caspase-3/7试剂应按以下步骤准备：

1)用DMSO配制2mM储存液；

2)使用前用预热至37℃的无血清细胞培养基或PBS稀释储存液，终浓度为200nM。

5.4.5NileRed试剂应按以下步骤准备：

1)用DMSO配制1mM储存液；

2)使用前用预热好的无血清细胞培养基或PBS稀释储存液，终浓度为200-1000nM。

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5.4.6CMFDA试剂应按以下步骤准备：

1)用DMSO配制10mM储存液；

2)使用前用无血清培养基稀释储存液至工作液浓度（0.5-25µM），并将探针工作液于37℃预热。

5.4.7待测药物准备

应按以下步骤准备：

——根据药物说明书，使用适当的溶剂将待测药物完全溶解，配置成一定浓度的储备液；

——通过文献检索等方式，确认待测药物的最佳浓度范围，并在此范围内至少设计5个浓度梯度，

同时设对照组；

——如果药物需冷冻储存，避免3-4个以上的冷冻/融化周期；

——准备不含药物的对应溶剂用于溶剂空白对照。

5.4.8仪器准备

在测定前确保酶标仪读数的一致性、高内涵细胞定量成像分析系统或荧光显微镜等仪器运行正常。

6评价内容及流程

6.1DILI肝毒性评价指标

主要的DILI肝毒性评价指标包括：

——细胞活性。通过评估细胞活性，可以了解药物对肝细胞代谢活力和功能状态的影响，若细胞

的活力低于对照空白组的70%，则可以推断该药物可能具有潜在的细胞毒性效应，并据此来衡量它对

肝细胞生存力的具体损害程度；

——生化指标。生化指标ALT和AST是反映细胞受损程度的重要指标，可评估其对肝脏健康的

潜在影响；

——细胞活率。细胞活死评估通过考虑细胞死亡和存活的比例，能够评估药物对肝细胞的毒性效

应；

——细胞凋亡。细胞凋亡的程度可以衡量细胞程序性死亡的程度，是肝毒性的重要指标之一；

——脂肪变性。反映肝细胞脂质代谢紊乱的指标，药物引起的脂肪变性可能与肝脏损伤相关；

——胆汁淤积。胆汁淤积相关的指标对于鉴别是否存在胆道系统的损伤以及病情严重程度具有重

要意义。

——在评价药物肝毒性时，还需要考虑其他因素，例如药物代谢能力、细胞通透性和药物在体内

的输送等。

6.2操作流程

药物对人源肝脏类器官的毒性特征主要通过细胞活力读数，生化指标，以及细胞活率、细胞凋亡、

脂肪变性和胆汁淤积这4个评价指标来进行表征。流程如图1所示。

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