GB/T 14927.1-2008 实验动物 近交系小鼠、大鼠生化标记检测法

ICS65．020．30

B44

缮园

中华人民共和国国家标准

GB／T

14927．1—2001

代替GB／T

实验动物近交系小鼠、

大鼠生化标记检测法

Animals--

Laboratory

Methodsfor

biochemicalmarkersofinbredmiceandrats

2009-03-0

2008—12-10发布1实施

宰瞀鹛零瓣訾雠瞥霎发布中国国家标准化管理委员会仅19

GB／T14927．1—2008

前言

GB／T14927共分2个部分：

～第1部分为《实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测法》；

一一第2部分为《实验动物近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法》。

本部分为GB／T14927的第1部分。

14927．12001《实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测

本部分自实施之I：1起代替GB／T

方法》。

14927．1

本部分与GB／T2001相比主要技术差异如下：

a)在近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法中的电泳结果模式图基础上，增加电泳图谱；

点，大鼠增补血清碱性磷酸酶(Alp)和血红蛋白(Hbb)两个生化位点；

c)对部分溶液配方进行调整。

本部分的附录A、附录B、附录C和附录D为资料性附录。

本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。

本部分起草单位：全国实验动物标准化技术委员会。

本部分主要起草人：邢瑞昌、刘双环、岳秉飞、鲍世民、张连峰。

本部分所代替标准的历次版本发布情况为：

～—GB／T14927．11994，GB／T14927．12001。

GB／T

实验动物近交系小鼠、

大鼠生化标记检测法

1范围

GB／T

14927的本部分规定了对近交系小鼠、大鼠生化标记进行检测的醋酸纤维膜(板、硬膜)的电

泳方法及判断标准。

本部分适用于近交系小鼠和大鼠任何品系。

2术语和定义

l

下列术语和定义适用于6B／T4927的本部分。

2．1

生化标记biochemicalmarker

表明遗传特征并采用生化方法识别的记号。在小、大鼠中多为一些同工酶和异构蛋白。

2．2

生化遗传概貌biochemical

geneticprofile

各种近交系多个生化遗传标记表型资料的汇总，从一定程度上反应了各种品系的遗传特征。

2．3

纯合性homozygosity

同源染色体的相对位置上具有相同基因的状态。近交系动物通过连续的近亲交配绝大部分的位点

都具有纯合性。一个品系内任何个体问进行交配产生的后代也具有纯合性。

2．4

同基因性isogenicity

一个近交品系中所有个体在遗传上是同源的。因此在同一品系内任何个体问进行皮肤和肿瘤移植

不被当作异己而受到排斥。如列近交系动物的基因进行检测，一个品系内不同个体的基因型完全一致。

2．5

个体性individuality

就整个近交系动物而言，每个品系在遗传卜都是独特的，表现在相“{广泛的特性上，如生化遗传概

貌等。大多数近交品系可通过各自的生化遗传概貌相互区别。

3方法原理

在小鼠和大鼠体内存在着一峰同工酶和同种异构蛋白。町依据它们在特定电场内携带的电荷不同

采用电泳的方法将它们区分，并根据电泳带型即蛋白质的表现型推断其基幽型，建立各种近交系的遗传

概貌，定期对它们进行质量监测。

4设备和材料

4．1常压电泳仪(0～600V)。

4．2醋酸纤维素膜(板、硬膜)电泳槽。

4．3电泳点样装置。

C111×9

4．4醋酸纤维素膜(7CIll)。

1

GB／1’14927．1—2008

CFII×8cm)。

4．5醋酸纤维素板(6

CII]×9

4．6醋酸纤维素硬膜(7cm)。

4．74℃冰箱。

4．820℃或40℃冰箱。

4．94℃低温高速离心机。

4．10振荡仅。

4．11组织匀浆机(2mI。或5mI，)。

4．12抗凝毛细管。

4．13抗凝毛细管塞子。

4．14毛细管离心机。

4．15吸耳球。

4．16小砂轮。

4．17解剖板。

4．18手术剪，手术镊。

4．19竹镊子。

4．20微波炉。

4．2137℃温箱。

4．22玻璃器皿。

6

4．23Cnl×8cn'l×9

Cm或7Cnl玻璃板。

4．24普通滤纸。

4．25分析天平。

4．26pH计。

4．27紫外监测仪。

4．28实验室常规用品。

4．29化学试剂：见表1。

表1化学试剂

中文名称英文名称(或简写)分子式规格

三羟甲基氮基甲烷TrIsC。HllNO_f分析纯或化学纯

乙=胺四乙酸ED，IAC】nHl5N2()8分析纯或化学纯

硼酸boricacidH3803分析纯或化学纯

廿氨酸glycineC：H，Noz分析纯或化学纯

acidfICl分析纯或化学纯

盐酸hydrochtoric

双氧水peroxide30％solutionH¨)2分析纯或化学纯

hydrogen

柠檬酸cl”ateacidm()nohudrate(：6H8()7·H2()分析纯或化学纯

2H

sodiumdibasicNa2HP04·12()分析纯或化学纯

磷酸氧二：钠phosphate

KH

磷酸二氢钾potassiumdihydrogenphosphate2P()4分析纯或化学纯

氢氧化钠sodiumhydroxideNaOH分析纯或化学纯

odiumaceta{eNaC?H30?分析纯或化学纯

无水醋酸钠anhydrous

琼脂粉分析纯或化学纯

醋酸镁Mg(C?H2(J2)2分析纯或化学纯

14927．1—2008

GB／T

表1(续)

中文名称英文名称(或简写)分子式规格

氯化锰chlorideMnClz分析纯

manganese

丽春红一SC22H1。N4Na40…S分析纯

三氯乙酸trichloroacelicacidCC】，COOH分析纯或化学纯

磺基水杨酸saIfosalicvlicacldC，H60^S·2H20分析纯或化学纯

巴比妥barbitalCRH】2N2()H分析纯或化学纯

sodiumbarbitalNa

巴比妥钠CRIt】2N203分析纯或化学纯

chloride

氯化镁magnesiumMgCI，·6H20分析纯或化学纯

乙二胺四乙酸二钠Na，EDTAC1。H1dN2Na20分析纯或化学纯

ferric

chlorideFeCl3分析纯或化学纯

三氯化铁anhydrous

kalium

铁氰化钾ferricyanntumK．、[Fe(CN)。：分析纯或化学纯

ammoniumNH。()H

氢氧化铵hydroxide分析纯或化学纯

醋酸CH、COOH分析纯或化学纯

丙酮CHICOCH2分析纯或化学纯

1C^H1109PNa，

葡萄糖一1一磷酸glucosephosphate

dlhvdrochlorlde

胱胺盐酸盐cystamineC4H】4C12N2S2

1，4dlthlohreltol(DTT)S

二硫苏糖醇C；H…O

acetate

4甲基散形乙酸盐4—methyl—umbelliferyC】【】ItsO_

acetteC12H1。()2

日乙酸萘酯pnaphthyl

口一磷酸萘酯钠盐pnaphthy[acidphosphateC㈤HR()4PNa

disodiumsalt

口一磷酸萘酚二钠盐I?-naphthylphosphateC10H，()4PNa2

n果糖6磷酸1)fructose-6disodiumsaltC6H【l()gNa2P

phosphate

bluetetrazo]iumbromide(MTT)Cl8Hl6BrN8S

溴化甲基噻唑蓝thiazolyl

H

辅酶1Iadeninedinucleotide(TPN)C2l27N7()】7P3

pnieotinamide

Nsulfate(PMS)

甲硫吩嗪酸酯methylphenaziniummethylClHHl【N2CH3S04

异柠檬酸三钠盐DI。isoeitricacidtrisodiumsaltC6H。()7N砒

1．6P?

葡萄糖l，6=磷酸glucosediphosphaleC。H…()12

葡萄糖6磷酸6C6Hl3()9PNa2

I)_glucosephosphate

6

葡萄糖6磷酸脱氧酶glucosephosphatedehydr。genase

DI。mallcacidH

苹果酸H()2CCH2(OH)C02

坚固蓝RR盐fastblueRRsahCl。Hl4N≈03+1／2ZnCl4

1-alanine

I。白氨酰替I。丙氨酸I。leuevlC9H】8N2()3

过氧化物酶

邻二甲氧基联苯胺盐酸盐。一dianisidinedlhvdrochl()rlde[c。H。(OCH。)NH。]?

acidNa。

p磷酸萘酚口naphthylphosphateC1011BO{P

sulfate

硫酸镁magnesiumMgSO一·7H，O分析纯或化学纯

3

14927．1—2008

GB／T

5生化标记检测方法总则

5．1电泳样品的制备

5．1．1血浆

min，分离血浆和血球，吸出血浆备用。

以抗凝毛细管行眼眶采血术，500×g，离心5

5．1．2溶血素

在去除血浆的富含红血球的试管内加入蒸馏水，红血球与蒸馏水的比例一般为1：4(V／V)，振荡

1min，成为红色透明液体，即为溶血素。

5．1．3组织匀浆上清液

cm～8

采用安死术处死动物，剖腹，小鼠取肾脏1只，肝脏1叶；大鼠取肾脏1只，小肠6CI／I·，睾丸

1只，并开胸取肺脏1叶。分别加入适量预冷蒸馏水，蒸馏水与组织的比例一般为2：1(V／m)。分别用

组织匀浆器匀浆。匀浆液置4℃低温高速离心机中，2000×g，30

中备用。

5．1．4样品保存

上述制备样品均宜新鲜使用，在4℃普通冰箱中只能保存一天，在一20℃或一40℃低温冰箱中保

存不超过一个月。

5．2电泳步骤

5．2．1浸膜

将醋酸纤维素膜(板、硬膜)轻轻浸入相应的电泳缓冲液(参见附录A)中，浸入时应避免膜(板、硬

膜)上出现气泡。

5．2．2点样

将浸透的膜(板、硬膜)，取出以滤纸吸干，纤维素膜(板、硬膜)面朝上，平置在点样板上，以点样器取

预置在样品槽内的编号样品，在膜(板、硬膜)上点样。一次点样量为0．3pI。，为增加膜(板、硬膜)上的

样品量，可重复点样，最适点样量不宜超过0．9／zI，(三次)。

5．2．3电泳

以记号笔在膜(板、硬膜)上标明原点，泳动方向，迅速将膜(板、硬膜)搭在事先放人缓冲液的电泳槽

纸桥上，盖上电泳槽，接通电源，电泳条件见相关条款。

5．3染色

5．3．1蛋白染色法

rain后以竹镊子取出换以5％～7％醋酸

电泳结束后取出膜(板、硬膜)置人0．2％丽春红染液中，5

脱色直至电泳区带清晰可见。

5．3．2酶显色板法

适用于醋酸纤维素膜。

mI。～4

5．3．2．1将酶显色液(参见附录B)新鲜混和。加入2％热琼脂3mI。，迅速混匀，均匀倒置在

7C112×9

cm的玻璃板上，制成酶显色板。

5．3．2．2电泳结束后取出膜将点样面贴在酶显色板上，注意将膜与酶显色板间的气泡排尽，但不可移

动膜的位置。

5．3．2．3将带膜显色板移至37℃温箱保温，直至酶区带清晰显现。

5．3．2．4取下已显色的膜浸入5％～7％醋酸中终止反应。

5．3．3琼脂覆盖法

适用于醋酸纤维素板(硬膜)。

5331电泳结束后取出醋酸纤维素板(硬模)。

3mI～3

532新鲜混和酶显色液．迅建与2m1．2蹦热琼脂混匀，均匀倒放在水平放置的醋酸纤维素

板(硬模)上。

5333待琼脂冷却固定后．将醋酸纤维索板(硬模)移人37℃温箱-茛至酶区带清晰疑现。

5334将醋酸纤维素板(硬模)放^5％～7％醋酸中终止反应。

6小鼠生化标记检测细则

6l

1碱性磷酸酶l(alkalinephosphatascI，Akpl)Chr

6I1样品：肾匀浆，06，tI．。

8

6{2缓冲液rris—Cilrate3参虬附录A的第A9章。

pH

6{3电泳支持物：醋酸纤维硬膜(板)。

V．f_40

6{4电泳条件：u一200rain．移动方向由负极至正扳。

6}5染色方法琼脂覆盖法。

11尊。

6{6染色液参见附录B的第B

6j7标准对照：

Akp]aC5781．／6J快带

AkplbCBA／N慢带

618判断方法：参照上述对照动物读出带型后与附录C作比较

619Akpl电泳结果及模式图，见图1。

+

ABBAABABABABBAABABAB

Phenmypc

nhbbb∞∞㈣bb∞bbG∞oUm”bbb……№∞№

图1AkpI电津结果殛模式图谱

62．Car2)Chr3

2碳酸酐酶2(carbonicanhydrase

621样品：溶血索．03，t1。。

2E1)‘FA5

62缓冲液NaC：H…OpHd参虬附录A的第A1章。

623电泳支持物：醋酸纤维索硬膜。

V．f=40

624电泳条件：U=200min．移动方向由正极堑负橄。

625染色方法蛋白染色法。

626染色液参见附录B的第B6章。

627标准对照：

aC57BI。／6J慢带

bBALB／cJ快带

628判断方法参j!}iJ．述对照动物读出带型后与附录c作比较

629(Tar2电泳鲇粜及模式图．”网2。

GB／1149271—2008

l——…一～

m。f-一-一一：一-一-

二】二】二】二】二1二】二】[】[r

H13I}BAABBAAAphcnO口”BBBBAAB11AAA

aa

bbbbbbbb∞nhb∞∞Ⅱ㈣wwbbbhbhbbaaabbb…a

圈2Car2电泳结果及模式图谱

7

6catelase，Ce2)Cbr

3肾过氧化氢酶一2(kidney

633

1样品：肾匀浆以蒸馏水1：3稀释，0pL。

63risCitrale7

2缓冲液：TpH6参见附录A的第A3章．

699电泳支持物：醋酸纤维索膜。

63V．t=25

4电沐条件：U一200min．移动方向…负极生Ⅱ。饭。

635染色方法：酶显色板法。

698章。

6染色液参见附录B的第B

637标准对照：

Ce2aBAI，B／cd快带

Cc2bCBA／N慢带

638判断方法：参照上述对照动物读出带型后与附求C作比较。

639Ce2电泳结果及模式图，见圈3。

AAAAABAAAAPhenotv∞AAAAAHAAAA

……aabb∞…aa…aaa∞aabb……a

G㈨Iyoc

图9Ce2电泳结果及模式图谱

8

6J)Chr

4酯酶1(esteⅧ牡I，Es

641样鼬血清，03“L。

64buffer72章。

2缓冲液phosphatepH0参见附录A的第A

649电泳支持物：酣酸纤维膜。

6440V，t一30

4电泳条件：U=1min．移动方向由m极至正极。

645染色方往：酶显色板法。

646染色液：参见附录B的第B1章。

647标准对照：

EHJaC57BI／6J№带

EsJbCBA／N慢带

6

4

68判断方法：参照上述对照动物读出带型后与附录c作比较

649Esl电泳结果及模式图，见图4。

“{·‘二二一=一_I

]

A^A^BABBBBAAAABABBBB

Phenoqpe

∞∞∞∞№ab№№bb∞∞∞∞∞abbbbb№

Oenoqpe

图4EsI电泳结果殛模式图谱

611

5酯酶3(esterase_3，Es3)Chr

651样品：肾匀浆。

8

652缓冲液：TrisGlycine9参见附录A的第A7章。

pH

653电泳支持物：醋酸纤维硬膜。

65V，t=28

4电泳条件：U一280min，移动方向由负极至正极。

655染色方法琼脂覆盖法。

65l章。

6染色液：参见附录B的第B

657标准对照

Es3aBAl，B／cJ慢带

Es3bTw快带

Es3cCBA／N最慢带

658判断方法：参照上述对照动物读出带型后与附录c作比较。

659Es3电泳结果及模式图，见图5。