GB/T 28642-2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应(PCR)法

ICS65.120

B46百目

中华人民共和国国彖标准

GB/T28642—2012

饲料中沙门氏菌的快速检测方法

聚合酶链式反应(PCR)法

RapiddeterminationofSalmonellaspp.inanimalfeedingstuffs—

PCRmethod

2012-07-31发布2012-11-01实施

GB/T28642—2012

-XX--J—

刖a

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。

本标准起草单位:农业部饲料质量及畜产品安全监督检验测试中心(沈阳)。

本标准主要起草人：张秀芹、张建勋、杜柏林、李欣南、杨希国、马俊驰、陈晓月。

GB/T28642—2012

饲料中沙门氏菌的快速检测方法

聚合酶链式反应(PCR)法

1范围

本标准规定了饲料中沙门氏菌的快速检测的PCR方法。

本标准适用于饲料中沙门氏菌的定性筛选。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T13091饲料中沙门氏菌的检测方法

GB/T14699.1饲料采样

GB19489实验室生物安全通用要求

SN/T1193基因检验实验室技术要求

SN/T1870食品中致病菌检测方法实时PCR法

3原理

利用沸水浴使菌体细胞破裂，释放基因组DNA,离心使细胞壁等有形物沉淀，以上清液为模板进行

扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

4试剂和材料

除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682的要求。

4.1沙门氏菌检测用引物(对)序列为：

SalF：5'-TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC-3

SalR：5'-GCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCT-3'

4.2PremixTag缓冲液(2X)：内含TagDNA聚合酶1.25U/25“L,4mmolMg21,dNTP

各0.4mmol0

4.3琼脂糖：电泳级。

4.4Marker20000

4.5缓冲蛋白豚水(BPW)：见A.1。

4.6大豆蛋白豚肉汤(RVS)：见A.20

4.7亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)：见A.3o

4.810倍上样缓冲液(10Xloadingbuffer)：0.05%的漠酚蓝，50%丙三醇溶液，1%的SDS。

4.9质控菌株:沙门氏菌阳性标准菌株。

4.1050XTAE缓冲液：见A.4。

1

GB/T28642—2012

4.111XTAE缓冲液：见A.5O

4.12漠化乙锭(5mg/mL)：见A.6。

注：4.2和4.8缓冲液为商品化成品。以上用于PCR反应及电泳试验的试剂可用功能相当的其他产品替代。

5仪器设备

5.1PCR仪。

5.2恒温水浴锅。

5.3离心机：离心转速12000g。

5.4微量移液器。

5.5电泳仪。

5.6凝胶成像仪。

5.7天平：感量0.01go

5.8电热恒温培养箱。

6试样选取与制备

按照GB/T14699.1采样，将实验室样品充分混匀后密封低温保存待用，注意整个过程中不要将样

品人为污染。

7检验步骤

7.1样品的增菌及模板的制备

取25g样品于225mL的缓冲蛋白腺水(BPW,4.5)中，37°C±1°C培养18h±2h进行预增菌，取

0.1mL预增菌液转移至10mL大豆蛋白月东肉汤(R