GB/T 24829-2009 毛刺线虫属(传毒种类)检疫鉴定方法

ICS65.020.01

B16OB

中华人民共和国国家标准

GB/T24829—2009

毛刺线虫属（传毒种类）检疫鉴定方法

IdentificationofTrichodorusspeciesasvirusvectorsfor

importandexportquarantine

2009-12-15发布2010-06-01实施

发布

GB/T24829—2009

次

前言I

1范围1

2规范性引用文件1

3鉴定依据1

4仪器和用具1

5试剂1

6现场检疫2

7实验室检验2

8形态学鉴定2

9结果判断4

10样品保存4

附录A（资料性附录）毛刺线虫传毒种类基本信息表5

附录B（资料性附录）线虫分离方法6

附录C（资料性附录）线虫玻片标本制作方法7

附录D（资料性附录）4种传毒毛刺属线虫测计值表8

附录E（资料性附录）毛刺属种类鉴定多歧检索表（雄虫）9

附录F（资料性附录）毛刺属种类鉴定多歧检索表（雌虫）13

附录G（资料性附录）多歧检索表应用参考图17

附录H（资料性附录）4种传毒种形态图22

参考文献26

GB/T24829—2009

-1.Z-—1—

刖弓

本标准的附录A、附录E、附录C、附录D、附录E、附录F、附录G和附录H均为资料性附录。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局检验检疫技术中心、广东出入境检验检疫

局，云南出入境检验检疫局、浙江大学。

本标准主要起草人:顾建锋、赵立荣、陈先锋、郑炜、李戌清、杜宇。

T

GB/T24829—2009

毛刺线虫属(传毒种类)检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了毛刺线虫属传毒种类的检疫鉴定方法。

本标准适用于植物、介质及土壤中毛刺线虫属传毒种类的检疫和鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是标注日期的引用文件，其随后所

有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研

究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不标注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

SN/T1157进出境植物苗木检疫规程

SN/T1158进出境植物盆景检疫规程

3鉴定依据

中文名：毛刺线虫属。

英文名:stubbyrtncmatode

毛刺线虫属(TrichodorusCobb,1913)隶属于线虫门[Nematoda(Rudolphi,1808)Lankester,

1877],无侧尾腺纲(AdenophoreaLinstow,1905)，三矛(TriplonchidaCobb,1922)，膜皮亚(Diph-

therophorinaCmans&Lf,1970),毛刺总科[Trichodoridca(Thorne,1935)Siddiqi,1974],毛刺科

[Trichodoridae(Thorne,1935)Siddiqi,1974],毛刺亚科(TrichodorinaeThorne,1935)

毛刺线虫属至今已发现56种，为多年生草本或木本植物的根部迁徙性外寄生线虫。不但直接取食

植物根系造成植物根系粗短、肿大、侧根增多,并引起寄主营养不良、生长失调等危害，更严重的是已知

其中有4种能传播烟草脆裂病毒(tobaccrattlevirus,TRV)和豌豆早褐病毒(peaearly-browningvi­

rus,PEBV)等病毒(参见附录A)。它们分别是圆筒毛刺线虫(TrichodoruscylindricusHper,1962)、

原始毛刺线虫[Trichodorusprimitivus(deMan,1880)Micoletzky,1922]、相似毛刺线虫(Trichodorus

similisSeinhorst,1963)和具毒毛刺线虫(TrichodorusviruliferusHper,1963)。

毛刺线虫主要通过带根苗木、土壤及介质传播，其雌、雄虫形态学特征是种类鉴定的主要依据，寄主

范围和地理分布等信息可供参考(参见附录A)。

4仪器和用具

4.1仪器

生物显微镜(50倍〜1000倍)、体视显微镜(10倍以上，具透射光源)、电热恒温培养箱、移液器

(20yL〜200卩L)、离心机(2000r/min以上)。

4.2用具

钟面皿或培养皿、盖玻片、载玻片、剪刀、挑针、酒精灯、线虫滤纸或纱布、500“L塑料管、细胞培养

皿、密闭塑料盒、漏斗、漏斗架、乳胶管、止水夹、加热板、分样筛(500目)。

5试剂

4%甲醛、甘油、指甲油、石蜡、溶液I(96%乙醇：甘油：蒸憎水=20:1:79)、溶液U(甘油：96%

乙醇=1:19)

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6现场检疫

注意观察苗木的生长状况、根部为害状，以及是否带介质、土壤等。重点选取有生长不良或粗短根

等症状的苗木及根际介质或土壤，如无可疑症状则按要求随机取样。取样后立即置密封塑料袋,标记后

及时送实验室检测。

具体抽样比例按SN/T1157和SN/T1158执行。

7实验室检验

7.1线虫分离

线虫分离方法参见附录B

7.2体视显微镜镜检

毛刺属线虫多数体长500“n〜1000卩m,放大10倍以上可见。虫体呈圆柱形，短胖，行动缓慢。

7.3标本制作

若发现可疑毛刺属线虫，需制作临吋玻片或永久玻片（参见附录C）。

7.4生物显微镜观察、摄影和测量

应针对雌、雄虫主要鉴定特征仔细观察并显微摄影，重点包括整体形态、齿针、雌虫阴道骨化结构及

侧体孔、雄虫交合刺及泄殖腔前附着器等，并在每张图片上加相应标尺。

需观察、测量获得多岐检索表中各鉴定特征数字代码（参见附录D、附录E、附录F、附录G）,并计算

a、b、V等值。样品足够吋，应观察和拍摄雌、雄虫各15条以上。

8形态学鉴定

&1毛刺属形态鉴定特征

雄虫：热杀死后虫体尾部显著腹弯，呈“J”形，表皮不强烈膨胀，后食道腺通常不覆盖肠（但有时背面

或腹面覆盖肠）。通常有1个〜3个腹中颈乳突，偶尔缺或有4个，一般于齿针基部和神经环之间具

1对侧颈孔。精子大，具呈香肠形或圆形的大精核。交合刺腹弯，光滑或具有纹饰、刚毛或缘膜。交合刺

悬肌形成显著的悬肌囊包围交合刺，无交合伞（除T.paracedarus和T.cylindricus外）。通常有3个

泄殖腔前附着器，很少为2、4或5个，通常至少有1个在缩回交合刺区域内。斜纹交配肌延伸到距缩回

交合刺基端数倍体宽处。

雌虫：热杀死后略向腹面弯曲，双生殖腺对伸，有受精囊（除T.nanjin^ensis外）。阴道约占半个体

宽，阴道收缩肌发达，骨化结构显著。阴门孔状或横裂，很少纵裂。通常有1对〜4对侧体孔，其中1对

侧体孔位于阴门附近一个体宽内，并且通常位于阴门后。肛门位于近末端,尾短圆，有1对尾孔。

雌虫阴道骨化结构的形状以及雄虫交合刺的形状是最重要的种类鉴定依据，其他主要鉴定特征还

有齿针长度、交合刺长度、泄殖腔前附着器、腹中颈乳突、交合刺的纹饰、雌虫侧体孔、引带等。

&2传毒种类形态鉴定特征

传毒种类形态鉴定特征参见附录H。

&2.1圆筒毛刺线虫（T.cylindricusHper.1962）

雄虫：热杀死后虫体后部较直。排泄孔前有3个腹中颈乳突，第1个腹中颈乳突位于齿针区域内，

在齿针基部稍后有1对侧颈孔。具3个泄殖腔前附着器，最后一个位于缩回交合刺区域内。交合刺通

常具光滑的柄状体，杆部前具横纹和刚毛，杆部后膨大且光滑，具较小的交合伞。

雌虫：热杀死吋虫体向腹面微弯曲，食道与肠从腹面略重叠，其他前部特征与雄虫相同。阴道为桶

状，阴门骨化结构发育良好，侧面观为圆三角形，且三角形尖端指向阴门。阴门腹面观为一短横裂，有

1对阴门后体孔。

与近似种比较：圆筒毛刺线虫雄虫与T.cottieri、T.obscuras相似，三者交合刺的杆后部膨大，且最

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后一个泄殖腔前附着器明显位于缩回交合刺区域内。但三者在交合刺大小及形态、腹中颈乳突的数量

（分别为3个、1个、0个）、热杀死后虫体后部形态（圆筒毛刺线虫虫体直且具交合伞，而T.cottieri和

T.obscurus虫体向腹面弯曲、不具交合伞）等方面不同。另外，圆筒毛刺线虫雄虫与T.paracedarus也

很相似，两者虫体后部均较直、具交合伞、交配肌较该属典型的交配肌弱，但两者可依据交合刺形态区

分。圆筒毛刺线虫.T.cottieri.T.obscurus雌虫阴门均为横裂，但可依据阴门骨化结构的形态区分。

8.2.2原始毛刺线虫[T.primitivus（deMan,1880）Micoletzky,1922]

雄虫：排泄孔位于神经环对应处或稍靠后。排泄孔前具腹中颈乳突3个，第一个位于齿针的中部对

应处，第二个位于齿针的基部对应处，第三个在神经环稍前对应处。1对侧颈孔位于齿针的后三分之一

处。精子大，具横纹，精核香肠形，长约9交合刺基部宽约3Mm~4Mm,杆部向后渐窄，末端宽约

1Mm交合刺外伸时中部可见几根细刚毛。引带形状特殊，前部凸起，大部分在交合刺之间。具泄殖腔

前附着器3个,最后一个位于交合刺基部对应处。

雌虫：具近阴门侧体孔1对，位于阴门稍后，另1对位于阴门前3个体宽处，还有1对位于阴门前

5个〜7个体宽处。阴道骨化结构明显，呈棒状，与阴道平行。阴门为微小的横裂，阴道菱形至长菱形。

食道球与肠邻接，不从背面或腹面覆盖肠。

与近似种比较：原始毛刺线虫交合刺形状与T.aquitanensis和T.hooperi相似，都是基部宽，向末

端渐狭，杆部细。该线虫与T.aquitanensis都具有3个腹中颈乳突，且其中前2个都在齿针区（T.hoo-

Peri只有2个腹中颈乳突）。该线虫雌虫阴门横裂与T.aquitanensis相似，骨化结构的走向与具毒毛刺

线虫相似，都是与阴道平行。原始毛刺线虫与T.aquitanensis的主要区别是雄虫交合刺形态和雌虫阴

道骨化结构aquitanensis的阴道骨化结构为四边形，而原始毛刺线虫为棒状。该线虫与具毒毛刺线

虫的区别为雄虫的交合刺形状不同，雌虫的阴道骨化结构和阴门裂口形状不同。

8.2.3相似毛刺线虫（T.similisSeinhorst,1963）

雄虫：排泄孔在神经环后约1个体宽处，排泄孔前有3个腹中颈乳突，第一个通常位于齿针后四分

之一对应处，很少在齿针基部。在齿针基部附近两侧有明显的侧颈孔"精子大，细胞核不规则椭圆形，

2MmX5.5Mm~6.5Mm交合刺向腹面弯曲，基部缢缩呈头状，杆部中间略宽，无横纹，后渐细，末端

钝。回缩的交合刺通常表面光滑，而伸出的交合刺狭窄的颈部可见有几根细刚毛。引带长约16“m,引

带头部具钩，端部膨大成球状。有3个泄殖腔前附着器，最后一个位于与交合刺基部对应处或略靠前。

雌虫：紧靠阴门后有一对侧体孔。阴门横裂，阴道圆形至菱形，仅在阴道基部可见阴道收缩肌。阴

道骨化结构大而明显，圆三角形。

与近似种比较：相似毛刺线虫与T.variopapiLLatus在交合刺的形状（向腹面弯，具柄状突起）、有

3个腹中颈乳突（其中1个位于齿针区内）、具3个泄殖腔前附着器以及雌虫阴门裂形状上相似，但相似

毛刺线虫雄虫比T.variopapillatus短，交合刺更粗且有细刚毛，而T.variopapillatus交合刺更细，无

细刚毛。另外，相似毛刺线虫雌虫阴道圆形至菱形、骨化结构为中等大小圆三角形、侧体孔1对，而

T.variopapillatus雌虫阴道筒形、骨化结构为大圆三角形至梯形、侧体孔2对。相似毛刺线虫与

T.complexus和T.coomansi交合刺形态相似,但腹中颈乳突的数量和交合刺形状不同。

&2.4具毒毛刺线虫（T.viruliferusHper.1963）

雄虫：排泄孔前具腹中颈乳突3个，排列间隔几乎相等，第一个通常明显位于齿针区内，第二个位于

齿针基部。紧靠齿针基部后两侧的侧颈孔明显。精子大，精核大、香肠形，约2MmX9（um交合刺头部

不明显无横纹，近基部宽，向腹面弯曲，渐渐变狭，在中部微收缩,后加宽，再向末端渐细。交合刺中部收

缩处有数根细刚毛。引带位于交合刺间，端部背侧明显凸起，似鞋跟。具泄殖腔前附着器3个，最后一

个位于缩回交合刺基部稍前。

雌虫：阴门后有一对侧体孔，阴门开口为孔状。阴道骨化结构小，呈卵形，以45°角与阴道倾斜或与

阴道几乎平行。阴道长宽大致相当，呈菱形，阴道收缩肌发达。

与近似种比较：具毒毛刺线虫与T.lusitanicusT.azorensisT.beirensis^T.velatus相似，都表现

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为雄虫交合刺中部有缢缩并具细毛。但可以从交合刺中部缢缩的程度、缢缩区的长度以及交合刺杆部

较细等特征与其他种区分。雌虫的主要区别是阴道和阴道骨化结构的形态差异。

9结果判断

将观察、测量获得的各鉴定特征数字代码与多歧检索表按字母顺序进行核对，如果所有数字均与某

种相符，则初步鉴定为该种。

若初步鉴定为圆筒毛刺线虫、原始毛刺线虫、相似毛刺线虫或具毒毛刺线虫，且符合第8章对应形

态鉴定特征以及测计值，可判为检出毛刺线虫属传毒种，其寄主和地理分布等信息可供参考。

10样品保存

10.1苗木保存

若鉴定为毛刺线虫属传毒种类，应对带病苗木的根部及整体摄影，置于密封塑料袋中4C左右保存

2个月以上，以备复验。

10.2线虫保存

若鉴定为毛刺线虫属传毒种类,应将剩余的线虫杀死、固定制成永久玻片保存；也可用4%甲醛固

定后长期保存。标签中应写明样品编号、制作人、制作吋间、寄主、产地、种名等信息。

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附录A

（资料性附录）

毛刺线虫传毒种类基本信息表

表A.1毛刺线虫传毒种类基本信息表

种类分布寄主范围所传病毒种类

该种线虫通常存在于沙质土壤中，

英国、丹麦、比利时、德取食寄主范围较毛刺线虫属其他

圆筒毛刺线虫国、波兰、瑞典、瑞士、法种窄。路边草皮利牧场是其最佳

烟草脆裂病毒（TRV）

(T.cylindricus)国、意大利、荷兰、西班寄主，但马铃薯、萬苣、甜菜、草莓、

牙、美国（佛罗里达）常绿针叶树根围土壤中也常常n〔

以分离到该种线虫。

主要有甜菜、卷心菜、红花苜蓿、含

羞草、芹菜、玉米、紫花苜蓿、黄瓜

和烟草等。其他有关的植物还有

英国、爱尔兰、比利时、德

燕麦、黄杨、茶花、棉花、灰胡桃树、

国、波兰、瑞士、瑞典、法

胡枝子、含羞草、松属、豌豆、马铃

原始毛刺线虫国、意大利、荷兰、挪威、烟草脆裂病毒（TRV）、

薯、普通繁缕、苹果、西梅脯、冠状

（T.primitivus）丹麦、保加利亚、葡萄牙、豌豆早褐病毒（PEBV）

银莲花、草莓、甘蓝、李属、黑穗醋

罗马尼亚、斯洛伐克、俄

栗、葡萄、胡萝卜、北美云杉、欧洲

罗斯、美国、新西兰

云杉、长白松等各种针叶木和阔叶

木、薄荷、酸模、橄榄、英国榆、柑橘

和菊花等。

主要分布于各种林地、草坪和耕地

英国、比利时、德国、波等，有关植物包括地中海柏树、高

兰、瑞士、法国、意大利、粱、梨、唐菖蒲属、云杉属、大麦、油

相似毛刺线虫荷兰、挪威、希腊、瑞典、菜、烟草、草莓、藜、越橘、桃、英国

烟草脆裂病毒（TRV）

（T.si?nilis}丹麦、保加利亚、罗马尼核桃、欧洲李子、普通繁缕、胡萝

亚、斯洛伐克、俄罗斯、美卜、紫花苜蓿、多年生黑麦草、白三

国（佛罗里达、密西根）叶草、大麦、洋葱、辣椒、豌豆和马

铃薯等。

主要包括小麦、黑麦、大麦、马铃

英国、比利时、德国、波薯、苹果和豌豆等，其他相关植物

兰、法国、意大利、荷兰、还有甜菜、禾本科植物、葡萄、玉

具毒毛刺线虫烟草脆裂病毒（TRV）、

西班牙、瑞士、保加利亚、米、橄榄、梨、桃、番茄、洋蓟、辣椒、

(T.viruliferus)豌豆早褐病毒（PEBV）

匈牙利、瑞典、美国（佛罗杨树、榛实、橡树、柑橘、无花果、柠

里达）檬、胡桃、百慕达草、蒲公英属和白

松等。

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附录B

（资料性附录）

线虫分离方法

B.1漏斗法

将10cm〜15cm直径的漏斗固定在支架上（见图B.1）,下端接一段乳胶管，管的近末端用止水夹

夹紧。将待分离的样品用纱布包好（根或其他植物组织应先剪成小段），轻轻放入盛有适量清水的漏斗

（使样品略露出水面为宜）。20C〜25C左右静止24h〜48h后，打开止水夹，用培养皿或钟面皿接取

线虫液约5mL~10mL,镜检。

1漏斗；

2——用纱布包裹的样品；

3——乳胶管；

4——止水夹。

图B.1漏斗分离装置

B.2浅盘分离法

浅盘分离法装置（见图B.2）由两只不锈钢浅盘、线虫滤纸或纱布组成，上盘底面为10目的粗筛网，

下盘为正常浅盘。分离线虫时，将线虫滤纸或纱布平铺在上盘的筛网上，然后将待分离的样品撒铺在表

面，从两只浅盘的夹缝中加水，以刚淹没供分离的样品为宜。20C〜25C左右静止24h〜48h后，移

去上盘及样品，用500目筛网收集线虫，然后将线虫液转移到培养皿或钟面皿，镜检。

1上盘;

2下盘。

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附录C

（资料性附录）

线虫玻片标本制作方法

C.1临时玻片制作

先在载玻片中央加1小滴水，然后在体视显微镜下用线虫挑针挑取数条线虫至小水滴中；或直接用

200»L移液器吸取数条线虫，滴加到载玻片上。手持载玻片在酒精灯火焰上来回5s~6s,使线虫恰好

被杀死，盖上盖玻片。

C.2永久玻片制作

C.2.1在解剖镜下，用移液器反复从培养皿中吸取线虫，转移到500卩L塑料管中，尽量使多数线虫被

转移。2000r/min离心3min,使线虫沉降到塑料管底部。

C.2.2用移液器将塑料管上层的水吸出，使管中仅留少量的线虫液（约10mL）,然后向管中加入95C

的4%甲醛，杀死线虫。静置数天，固定线虫（可长期保存）。

C.2.3将塑料管2000r/min离心3min,吸去上层甲醛溶液后，用移液器将线虫移至细胞培养皿中，

加入溶液I至皿的一半体积，再将皿置于加有1/10体积96%乙醇的密闭塑料盒中，置40C恒温培养

箱中放置12h0

C.2.4仔细用移液器吸去皿中大部分溶液I（注意不要移走线虫），加满溶液U,置于40C恒温培养

箱中放置12h以上，直至乙醇完全挥发。

C.2.5取一干净载玻片，在中间加一小滴甘油，在解剖镜下用挑针将已完全脱水的雌、雄线虫各数条

移至甘油滴的中央，排列均匀。取与线虫直径大小一致的玻璃丝3根〜4根，放在甘油滴的边缘。

C.2.6在甘油滴两边对称放两块小蜡块，加盖玻片，置于64C的加热板上加热，待蜡块融化后自然冷

却。用指甲油封片，待指甲油干后再封1次。贴上标签，写明样品号、寄主、产地、制作日期等，放入标本

盒中（保存时注意保持玻片水平，以防线虫滑动）。

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附录D

(资料性附录)

4种传毒毛刺属线虫测计值表

表D.14种传毒毛刺属线虫测计值表

传毒线虫测计值

种类L(ptm)abSt(卩m)VSp(卩m)

822±5552.0±3・145.0±5.3

雄虫18.6〜3&94.0〜6.5—

原始毛(500〜1000)(47.0〜58.5)(32.0〜54.0)

刺线虫

769±3355.0±2・357.5士0.6

雌虫18.0〜2&04.4〜5・8—

(500〜950)(2&0〜57.0)(54.0〜59.2)

678±5839.2±3.134.2±1.7

雄虫19.5〜32・74.3〜11・3—

相似毛(550〜1059)(35.0〜50.0)(30.0〜44.0)

刺线虫

692±5646.5士2.354.7±4.2

雌虫17.9〜30.04.6〜11.0—

(600〜1000)(36.0〜52.0)(43.0〜60.0)

652±3536.6±2.324.2±1.3

雄虫17.6〜33.04.2〜11・5—

具毒毛(616〜890)(32.0〜53.0)(22.0〜37.0)

刺线虫

638±4937.4±1.255.1±1.0

雌虫17.3〜2&03・9〜12.4—

(552〜919)(36.0〜56.0)(51.0〜62.0)

71020.74.940.037.0

雄虫—

圆筒毛(630〜800)(18.5〜22.7)(4.1〜5.7)(37.0—43.0)(33.0〜49.0)

刺线虫

69020.84.840.05&0

雌虫—

(580〜770)(17.9—22.8)(4.3〜5.8)(35.0〜45.0)(53.0〜65.0)

注1：L体长；a体长/最大体宽；b体长/虫体前端至食道与肠连接处的距离;St(onchiostyle)齿

针长；Sp(spicule)交合刺长；V虫体前端至阴门的距离X100/体长。

注2：表内数据参考Decraemer,1995。

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