GB/T 45202-2025 牛体外胚胎生产和移植技术规程

ICS6502030

CCSB.43.

中华人民共和国国家标准

GB/T45202—2025

牛体外胚胎生产和移植技术规程

Codeofpracticeforinvitroembryoproductionandtransferincattle

2025-01-24发布2025-08-01实施

国家市场监督管理总局发布

国家标准化管理委员会

GB/T45202—2025

前言

本文件按照标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则的规定

GB/T1.1—2020《1:》

起草

。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任

。。

本文件由中华人民共和国农业农村部提出

。

本文件由全国畜牧业标准化技术委员会归口

(SAC/TC274)。

本文件起草单位西北农林科技大学内蒙古大学天津力牧生物科技有限公司内蒙古赛科星繁育

:、、、

生物技术集团股份有限公司

()。

本文件主要起草人张涌刘军张景程李光鹏王勇胜李喜和孙伟张立郝少强王娜

:、、、、、、、、、。

Ⅰ

GB/T45202—2025

牛体外胚胎生产和移植技术规程

1范围

本文件确立了牛体外胚胎生产和移植过程中的操作流程规定了体外胚胎生产的基本要求供体的

,、

选择与处理卵母细胞采集体外成熟体外受精体外培养胚胎冷冻与解冻胚胎移植与妊娠检查技术

、、、、、、

要求描述了证实方法

,。

本文件适用于牛体外胚胎生产和移植

。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中注日期的引用文

。,

件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于

,;,()

本文件

。

分析实验室用水规格和试验方法

GB/T6682

牛胚胎

GB/T25881

牛体内胚胎生产与移植技术规程

GB/T26938

3术语定义和缩略语

、

31术语和定义

.

和界定的以及下列术语和定义适用于本文件

GB/T25881GB/T26938。

311

..

卵丘-卵母细胞复合体cumulus-oocytecomplexesCOCs

;

卵丘细胞包裹卵母细胞形成的复合体

。

312

..

体外成熟invitromaturationIVM

;

在体外适宜条件下培养使卵母细胞发育成熟排出第一极体并具有受精能力的过程

COCs,,。

313

..

精子纯化spermpurification

从精液中分离获得活精子的操作过程

。

314

..

体外受精

invitrofertilizationIVF

;

精子和成熟卵母细胞在体外环境下完成受精的过程

。

315

..

体外培养invitrocultureIVC

;

受精卵在体外适宜环境下培养的过程

。

32缩略语

.

下列缩略语适用于本文件

。

1

GB/T45202—2025

囊胚率

BLR:(blastocystrate)

卵裂率

CLR:(cleavagerate)

产犊率

CR:(calvingrate)

促卵泡素

FSH:(follicle-stimulatinghormone)

活体采卵

OPU:(ovumpick-up)

妊娠率

PR:(pregnancyrate)

4技术流程

见图

1。

图1牛体外胚胎生产和移植技术流程图

2

GB/T45202—2025

5基本要求

51设施设备

.

宜配备

:

设施百万级以上洁净实验室

a):;

仪器设备活体采卵仪体视显微镜离心机精子密度测定仪培养箱三气培养箱恒温

b):、、、、CO2、、

台水浴锅

、。

52培养条件

.

卵母细胞体外成熟和体外受精应在体积分数空气和饱和湿度下培养体外胚胎

38.5℃、5%()CO2;

应在体积分数体积分数体积分数和饱和湿度下培养

38.5℃、5%()CO2、7%()O2、88%()N2。

53试剂

.

531化学试剂纯度应达到细胞或胚胎培养级别的要求

..。

532试验用水应符合二级水的要求电阻率达到

..GB/T6682,18.2MΩ·cm(25℃)。

6供体的选择与处理

61供体的选择

.

供体应满足以下条件

。

符合本品种标准遗传性能稳定种用价值高三代系谱清楚

a),,,。

生殖器官和卵巢机能正常

b)。

青年牛宜为月龄以上经产牛宜产后以上体况适中评分宜以上分制

c)OPU10,40d;,2.75(5)。

无遗传缺陷病和传染病

d)。

62供体的处理

.

621非超排处理

..

利用活体采卵仪直接采卵宜间隔采集一次

,3d~4d。

622超排处理

..

供体超排处理程序如下

:

第天用活体采卵仪检查卵巢宜刺破直径ϕ的卵泡

a)0,()>5mm;

第天和第天间隔各注射一次可根据制剂活性供体品种和体况确定

b)2312hFSH,FSH、

适宜剂量

FSH;

第天进行

c)5OPU;

重复超排处理间隔宜大于

d)14d。

7卵母细胞采集

71供体屠宰后卵巢卵母细胞的采集

.

供体屠宰后的新鲜卵巢置于含有抗生素的生理盐水中内运输到实验室用

20℃~25℃,6h。

3

GB/T45202—2025

预热的生理盐水清洗次次一次性注射器或真空负压泵连接针头针口向下

30℃~37℃3~4。21G,

刺入ϕ的卵泡吸取卵泡液和移到细胞培养皿中置于恒温台上体视显微

2mm~8mm,COCs,,38.5℃,

镜下收集转移到预热的采卵液见附录中中

COCs,38.5℃(AA.1)。

72活体采卵

.

721采卵前准备

..

保定供体清除直肠宿粪硬膜外麻醉清洗消毒会阴部及外阴离心管与负压泵和采卵针

,,,、;50mL

连接置于恒温槽上吸取少量采卵液润洗采卵管

,;。

722采卵过程

..

供体采卵过程如下

:

操作人员一只手将活体采卵仪超声波探头插入供体阴道至穹隆处另一只手通过直肠把握将

a),

一侧卵巢隔着阴道穹隆壁紧贴超声波探头

;

调整超声波探头与卵巢的相对位置使卵泡位于进针线上开启真空泵并推进采卵针穿刺卵

b),,

泡采集卵泡液和

,COCs;

采集所有ϕ卵泡后冲洗采卵针及采卵管使进入离心管

c)2mm~8mm,,COCs;

采用同样的方法对另一侧卵巢进行采集

d)COCs;

如有血液阻塞采卵针或采卵管应将采卵针撤出并提高负压吸取采卵液以疏通采卵针和采

e),,

卵管

;

将采集的卵泡液和转移到集卵杯过滤液体置于恒温台上体视显微镜下收集

f)COCs,38.5℃,

转移到预热的采卵液中

COCs,38.5℃。

8体外成熟

81成熟液微滴的准备

.

在细胞培养皿中制作的成熟培养液见微滴用矿物油覆盖培养箱中平衡

100L(A.2),,CO22h

以上μ

。

82COCs的分级

.

体视显微镜下按形态学方法将分为如下个级别

COCs4。

级卵母细胞胞质均匀包裹层以上完整而致密的卵丘细胞级卵母细胞图见附录中

a)A:,5。AB

图

B.1a)。

级卵母细胞胞质均匀包裹层层的卵丘细胞级卵母细胞图见图

b)B:,3~5。BB.1b)。

级卵母细胞胞质均匀或不均匀包裹层层卵丘细胞级卵母细胞图见图

c)C:,1~3。CB.1c)。

级卵丘细胞已经松散或几乎是裸卵级卵母细胞图见图

d)D:。DB.1d)。

83COCs的培养

.

挑选级级和级采卵液中清洗次用平衡的成熟培养液清洗次移入成熟培养液

A、BCCOCs,3,3,

微滴中每头供体的应单独培养每个微滴宜个个置于培养箱中培养

,COCs,10~20COCs,CO2。

9体外受精

91受精液微滴的准备

.

在细胞培养皿中制作体外受精液见微滴用矿物油覆盖培养箱中平衡以上

90μL(A.3),,CO22h。

4

GB/T45202—2025

92卵母细胞的准备

.

体外成熟培养后用洗涤液见洗次转移到体外受精液微滴中洗次置

COCs20h~22h,(A.4)3,3,

于体外受精液微滴中每个微滴宜培养个个

,10~20COCs。

93精子的准备

.

精子的准备可选择下列方法之一

。

离心法吸取密度梯度离心液见置于离心管中再吸取密度

a):1.5mL90%(A.5.1),1.5mL45%

梯度离心液见小心置于上层避免摇动将水浴解冻的细管精液缓慢加到密度梯

(A.5.2),;37℃

度离心液顶部g离心机ϕ为离心吸取底部的精液加入

,1350r/min(200,20cm)10min;,

洗涤液重悬精子g离心机ϕ为离心后弃上清加入洗涤

1mL,1350r/min(200,20cm)5min,

液重悬精子精子密度宜调整至7个放回培养箱中待用

,1.9×10/mL,CO2。

上浮法水浴解冻细管精液缓慢加入至含精子上浮液见离心管底部倾斜

b):37℃,5mL(A.6),

放入培养箱中静置吸取上清液g

45°CO2,30min~40min;3mL~4mL,1350r/min(200,

离心机ϕ为离心后弃上清加入洗涤液重悬精子精子密度宜调整至7个

20cm)5min,,1.9×10/

放回培养箱中待用

mL,CO2。

94受精

.

取的重悬精子液加入含有的受精液微滴中培养箱中共孵育

5μLCOCs,CO212h~15h。

10体外培养

101培养液微滴的准备

.

在细胞培养皿中制作胚胎体外培养液见微滴用矿物油覆盖培养箱中平衡

50μL(A.7),,CO22h

以上

。

102体外培养

.

受精培养后将移入透明质酸酶工作液见中用吸管反复轻轻抽吸去除卵丘细胞及黏

COCs(A.8),,

附的精子用胚胎体外培养液洗次移入胚胎体外培养液微滴中在三气培养箱中培养每个微滴宜培

,3,,,

养枚枚胚胎

10~20。

103胚胎质量鉴定

.

按照的规定执行

GB/T25881。

11胚胎冷冻与解冻

111冷冻

.

可选择如下冷冻方法之一进行冷冻

:

程序化冷冻方法按照的规定执行

a):GB/T26938;

玻璃化冷冻方法将受精后第天或第天的可用胚胎移入玻璃化冷冻液见中平衡

b):671(A.9.1)

再移入玻璃化冷冻液见中平衡立即将胚胎置于冷冻载杆上投入液氮

30s,2(A.9.2)30s,,。

5

GB/T45202—2025

112解冻

.

采用如下解冻方法

:

程序化冷冻胚胎的解冻按照的规定执行

a):GB/T26938;

玻璃化冷冻胚胎的解冻将冷冻胚胎的载杆从液氮中取出立即放入预热的玻璃化解

b):,38.5℃

冻液见中平衡再移入玻璃化解冻液见中平衡在胚胎培养液

1(A.9.3)1min,2(A.9.4)5min,

中洗次

3。

12胚胎移植与妊娠检查

按照的规定执行

GB/T26938。

13证实方法

131过程记录

.

查验各环节的记录表照片影像材料等记录表应包括采卵记录表体外受精记录表胚胎冷冻解

、、。、、

冻记录表和胚胎移植记录表见附录

,C。

132胚胎发育率

.

包括卵裂率和囊胚率计算公式如下

,。

卵裂率按式计算

a)(1)。

n

=1×

CLRn100%…………(1)

2

式中

:

卵裂率

CLR——