DB37/T 4000-2020 羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测技术规程

ICS65.120

B46

DB37

山东省地方标准

DB37/T4000—2020

羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测技术

规程

TechnicalspecificationfordetectionofsheepclostridiumperfringensbyPCRand

ELISA

2020-06-08发布2020-07-08实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T4000—2020

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。

本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

本标准主要起草单位：山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心。

本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、闫振贵、彭军、胡莉萍、黄河、杨萍萍、柳洪洁、曹振山、王

敏、王世荣、郝长宝。

I

DB37/T4000—2020

羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测技术规程

1范围

本标准规定了羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测方法的技术规范。

本标准适用于羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB14925实验动物环境及设施

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

一抗

酶联免疫吸附试验（ELISA）中用于与包被的抗原结合的抗体称为一抗。阴阳性血清和待检血清统

称为一抗。

3.2

二抗

酶联免疫吸附试验（ELISA）中用于与一抗结合的抗抗体称为二抗。本标准中兔抗羊IgG抗体为二抗。

4试剂或材料

4.1产气荚膜梭菌

使用A型产气荚膜梭菌标准株CVCC41。

4.2产气荚膜梭菌阳性血清

羊经免疫产气荚膜梭菌抗原3次后获得的血清，每次免疫间隔两周。抗体中和试验检测效价高于

1:256（附录A）。

4.3阴性血清

从健康的未感染未免疫的羊分离的血清（附录A）。

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DB37/T4000—2020

4.4生化试剂

灭菌0.5%石炭酸生理盐水、PBS、PBST、Tris-HCL、牛血清白蛋白（BSA）、底物反应液（具体配制

方法见附录B）；PCRbuffer；dNTP；Taq聚合酶；溴酚蓝；二甲苯青；蔗糖；Tris-乙酸；乙二胺四乙

酸（EDTA）；溴化乙锭；琼脂糖；Tween-20；考马斯亮蓝G-250；考马斯亮蓝R-250；邻苯二胺（OPD）；

30%丙烯酰胺；十二烷基硫酸钠（SDS）；过硫酸铵（AP）；四甲基乙二胺（TEMED）；甲醛溶液；FT培

养基；产毒培养基；酵母浸膏粉；蛋白胨；L-精氨酸；糊精。

4.5水

试验用水符合GB/T6682三级水的规定。

5仪器设备

5.1微量移液器：量程为20μL～100μL。

5.2PCR管：200μL体积。

5.3灭菌吸管：1.0mL。

5.4恒温培养箱。

5.5匀速振荡器。

5.6离心机：转速不低于16000r/min。

5.796孔ELISA酶标板。

5.8PCR仪。

5.9酶标仪：波长范围340nm～850nm。

5.10分光光度计。

5.11玻璃比色皿。

6产气荚膜梭菌PCR检测方法

6.1本检测方法在200μL的离心管中进行，所使用的引物如下：

表1产气荚膜梭菌PCR引物序列

PrimersPrimersequence(5’-3’)Size(bp)

CPA-F