GBZ/T(卫生) 249-2014 荧光原位杂交分析染色体易位估算辐射生物剂量技术方法

ICS13.100

C60

中华人民共和国国家职业卫生标准

/—

GBZT2492014

荧光原位杂交分析染色体易位估算

辐射生物剂量技术方法

ㅤㅤㅤㅤ

Methodofdoseestimationusinchromosometranslocationwith

g

fluorescenceinsituhbridization

y

2014-05-14发布2014-10-01实施

中华人民共和国

发布

国家卫生和计划生育委员会

/—

GBZT2492014

目次

前言…………………………Ⅲ

1范围………………………1

2规范性引用文件…………………………1

3术语和定义………………1

4荧光原位杂交标本制备…………………2

5染色体易位畸变的荧光分析和记录……………………4

剂量效应曲线的建立……………………

6-4

7剂量估算…………………5

8质量控制…………………6

()

附录A资料性附录主要仪器设备和试剂配制………7

()

附录B资料性附录染色体涂染检测易位畸变示例…………………9

()

附录C资料性附录荧光原位杂交分析染色体易位畸变分析记录表和报告单……10

()

附录D资料性附录正常人各条染色体DNA含量占整个全基因组DNA的份额………………12

()

附录E资料性附录事故受照者回顾性生物剂量估算………………13

ㅤㅤㅤㅤ

Ⅰ

/—

GBZT2492014

荧光原位杂交分析染色体易位估算

辐射生物剂量技术方法

1范围

,

本标准规定了用荧光原位杂交分析外周血淋巴细胞染色体易位对电离辐射外照射受照人员的生

物剂量进行估算的技术方法。

。、

本标准适用于单色荧光素直接标记探针的染色体涂染方法适用于发生在年内剂量在

10

、,

0.2G~5G范围内急性全身均匀或近似均匀照射的事故受照人员回顾性剂量估算也可用于受过

yy

量外照射人员的生物剂量估算。

、、、

本标准不适用于慢性职业受照人员非均匀照射内照射剂量大于或发生时间大于年的

5Gy10

急性照射的剂量估算。

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文

。,()。

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/染色体畸变估算生物剂量方法ㅤㅤㅤㅤ

GBT28236

/用稳定性染色体畸变估算职业受照者剂量的方法

WST204

3术语和定义

/和/04界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

GBT28236WST2

3.1

荧光原位杂交;

fluorescenceinsituhbridizationFISH

y

。(;

非放射性原位杂交的一种将变性后的标记核苷酸探针包括直接与荧光素结合的直接标记探针

、)、

用生物素地高辛等标记的间接标记探针与变性后的染色体细胞中的核酸按照碱基互补配对原则进

,,。

行杂交经洗脱后直接分析或通过免疫荧光系统检测最后在荧光显微镜下观察

3.2

染色体易位chromosometranslocation

,,

两条染色体断裂后相互交换染色体的远侧部分形成两条具有着丝粒的衍生染色体的染色体畸

。,。

变有时交换是不完全的还可以产生一对无着丝点断片

3.3

染色体涂染chromosomeaintin

pg

(),。

用染色体特异性DNA文库作为探针池全染色体探针可涂染整条染色体的荧光原位杂交方法

3.4

剂量效应曲线

-dose-effectcurve

,

某种生物体系受到照射后的反应与受照射剂量之间存在着某种定量关系可用适当的数学模式表

,,。

述制备出相应的刻度曲线可用其估算受照射剂量

1

/—

GBZT2492014

4荧光原位杂交标本制备

4.1仪器和设备

涉及的主要仪器和试剂配制详见附录A。

4.2染色体标本制备

4.2.1样品接种和细胞培养

,

用0.5mL肝素抗凝全血加入到4.0mL含有20%胎牛血清的RPMI1640全培养基中每个样品

,。

设个平行样培养

248h~54h

4.2.2收获细胞

,,,,

用吸管吹打培养物转入15mL刻度离心管水平离心机250g离心10min弃去上清约留1mL

剩余沉淀物。

4.2.3低渗

/,,

每离心管中加入预温的至用吸管吹打均匀置水浴

37℃0.075molLKCl8mL~10mL37℃

中30min。

4.2.4预固定

ㅤㅤㅤㅤ

[()],,

每离心管中加入新配制的固定液甲醇冰乙酸体积分数用吸管轻轻吹吸混匀

2mL∶=3∶1

,。

250g离心10min弃去上清

4.2.5固定

,,,,。

每离心管中加入6mL固定液轻轻吹吸混匀室温固定20min250g离心10min弃去上清

4.2.6第二次固定

,,,,。

加入6mL固定液轻轻吹吸混匀固定15min250g离心10min弃去上清

4.2.7细胞悬液的制备

,

适于制片的细胞悬液在混匀后应是均匀乳白色的细胞悬液的颜色较深时可再重复4.2.6步骤

。,。

1~2次弃去部分上清留适量上清并混匀

4.2.8制片

、,

制片时将1~2滴细胞悬液滴在经无水乙醇处理无尘纸擦洗干净的玻片上湿热条件下使细胞和

,。

染色体均匀散开室温空气自然干燥

4.2.9染色体标本质量的检定

,、、、。

在相差显微镜下中期染色体应是中等灰色轮廓清楚分散良好很少或没有肉眼可见的细胞质

、、,。

可通过调节制片的温度湿度水平细胞悬液的浓度以得到最理想的中期分裂相

2

/—

GBZT2492014

4.3染色体标本预处理

4.3.1RNA酶处理

();;

用平衡磷酸盐缓冲溶液PBS在室温下洗5min在每个冰乙醇浓度中脱水5min室温空气自然

。,,。

干燥取100LRNA酶工作液加到标本上盖上24mm×50mm的盖玻片37℃湿盒中放置1h

μ

(),;,

用标准柠檬酸盐氯化钠液室温条件下洗次每次冰乙醇系列脱水电热板上

2×SSC-35min60℃

放置30min。

4.3.2蛋白酶处理

,,

染色体标本用RNA酶预处理后杂交检测后仍有非常多的背景荧光信号同一批标本就需要蛋白

。。

酶处理将100L37℃预温的0.005%的胰蛋白酶工作液加到标本上8min~10min用PBS在室

μ

,/,

温下洗5min然后用50mmolL氯化镁溶液室温条件下洗5min再用1%多聚甲醛室温下固定

。,;,

室温条件下在中漂洗次每次然后在冰乙醇系列室温下脱水每个浓度

10min2×SSC25min

;。

2min~5min室温空气自然干燥

4.4染色体标本变性

,(、)

染色体标本在的标本变性液中变性冰乙醇系列和乙醇脱

73℃2min~5min70%90%100%

,。。

水室温空气自然干燥在42℃电热板上预热5min

4.5探针变性

ㅤㅤㅤㅤ

、。,

使用混合好的同一荧光素直接标记某条或某几条染色体的染色体涂染探针探针在42℃预温

,。,

并充分摇匀并使液体沉于管底探针在73℃水浴中放置5min进行变性37℃水浴中放置40min~

60min进行预复性。

4.6预杂交

。

此步骤可在探针变性完成前30min开始进行在染色体标本上加100L70%甲酰胺-2×SSC-

μ

/,,。迅速去除盖玻片后

50mmolLPBS盖上24mm×50mm的盖玻片在80℃的电热板上放置3min

,。

在冰冷的乙醇中处理随后在和乙醇中室温处理各室温空气自

70%5min90%100%2min~5min

然干燥。

4.7杂交

,,。,

将20L探针加到已预杂交的标本上盖上盖玻片封片标本在37℃湿盒中避光过夜可以延长

μ

到2d。

4.8杂交后洗脱和复染

,、,

杂交后的标本取掉盖玻片后用的甲酰胺各洗次吐温

42℃50%-2×SSC0.1×SSC30.05%

,;。,

洗次每次室温空气自然干燥将用抗淬灭剂溶解的复染液直接加到标本上盖上

20-4×SSC15min

盖玻片以备分析。

4.9复染后标本的保存

。,

复染后标本在分析前应避光保存如果开始分析时间距复染完成超过1h应在-20℃条件下避

。。

光保存在该条件下保存的标本荧光信号至少可保持年

1

3

/—

GBZT2492014

5染色体易位畸变的荧光分析和记录

5.1荧光显微阅片

,,;

在荧光显微镜的低倍镜下先用复染荧光对应的滤光片调好焦距寻找合适中期分裂相然后在油

(),。

镜100倍下确定中期分裂相是否在视野正中间判断中期分裂相是否适合分析适合分析的中期分

:,,,,

裂相须符合染色体数目为46±1分散良好无细胞质染色体浓缩一个分裂相中标记的染色体最多

有两个交叉。

,,

找到适合分析的中期分裂相后更换至染色体标记荧光所对应的滤光片计数被标记的染色体数目

和判断是否存在染色体易位。

5.2染色体易位畸变判定标准

,

正常中期分裂相中荧光标记的染色体数目与预期标记的染色体数目一致染色体均为单一荧光染

,;,

色结构都是完整的如果荧光标记的染色体中某一条染色体显示种荧光染色而且仅出现另外一条

2

,,;

染色体为种荧光染色且每条染色体具有个着丝粒计为个染色体易位如果某一条染色体显示

211

,,,

种荧光染色且出现个无着丝粒断片该断片无标记荧光染色或部分标记荧光染色也计为个染

211

()。

色体易位见附录B

5.3数字图像显微摄影

,。,

检测到染色体易位畸变时需要对中期分裂相进行拍照荧光显微镜配有数码相机的可用数码相

,();

机拍下该中期分裂相的图像并在记录表附录C记录下文件名和中期分裂相图像特征荧光显微镜连

ㅤㅤㅤㅤ

,、,

接有冷电荷耦合元件镜头的数字化染色体图像分析系统按照软件手册进行图像捕获合成和保存记

录下文件名和中期分裂相图像特征。

、

5.4结果数据的记录处理和保存

5.4.1分析结果的记录

(

将选择分析的每一个中期分裂相记录在荧光原位杂交分析染色体易位畸变分析记录表附

)。

录C中

5.4.2全基因组易位率的换算

,():

将检测到的染色体易位率通过公式计算全基因组易位率

1

F

p…………()

FG=1

2.05()

f1-f

pp

式中:

Fp———检测到的染色体易位率;

FG———全基因组易位率;

———()。

f荧光标记的染色体DNA占整个基因组DNA的份额见附录D

p

剂量效应曲线的建立

6-

6.1供血者要求

、、,,、

2~3名成年健康人非放射工作者男女均可年龄在18~60岁半年内无急慢性疾病无射线和

,。

化学毒物接触史近一个月内无病毒感染史

4

/—

GBZT2492014

6.2照射条件

、;;;

应提供可靠的明确的被照射样品的物理剂量样品受照射均匀剂量范围在0.1G~5G照射

yy

//,,;

剂量率一般选择照射剂量点在个以下至少选个点在

0.3Gmin~1Gmin6~81G337℃±

yyy

,,。

0.5℃温度条件下进行照射照射后在上述温度下修复2h然后进行培养

、

6.3荧光原位杂交标本制备分析及记录

、。

荧光原位杂交标本制备染色体易位畸变荧光分析和记录按照第章第章中所述方法进行

4~5

6.4数据处理

2

,;

两组间差异用泊松分布的检验多组间差异用检验用全基因组易位率与照射剂量的关

U췍FG

,。

系进行曲线拟合对拟合回归方程进行假设检验用方差分析

剂量效应曲线拟合

6.5-

/。(),

参照WST204中相关章节对低传能线密度LET的电离辐射电离辐射诱导的染色体易位指

,():

标与受照射剂量之间的剂量效应关系以拟合二次多项式为宜按照公式进行计算

2

D2…………()

YcαD2

=++β

式中:

———(/);

Y本标准中指全基因组染色体易位率畸变细胞

———,();

D照射剂量单位为戈瑞Gy

———,(/);

c常数项本标准中指全基因组本底易位率畸变细胞

ㅤㅤㅤㅤ

β———剂量平方项系数;

α———剂量直线项系数。

,,():

对于高LET电离辐射剂量效应关系宜采用直线模式计算见公式3

…………()

YcαD3

=+

式中:

———(/);

Y本标准中指全基因组染色体易位率畸变细胞

———,();

D照射剂量单位为戈瑞Gy

———,(/);

c常数项本标准中指全基因组本底易位率畸变细胞

α———剂量直线项系数。

7剂量估算

、

7.1FISH标本的制备易位分析和数据处理

、、、、

所要估算剂量的样品染色体标本制备预处理杂交洗脱易位畸变判定标准和数据的处理等均应

与建立剂量效应曲线相同。

-

7.2分析细胞数的确定

,,():

可先分析200个细胞将得到的染色体易位率代入公式计算出需要分析的细胞数

P4

(p)

1-×96.04

…………()

n=4

p

式中:

n———需要分析的细胞数;

5

/—

GBZT2492014

p———易位畸变率。

96.04———根据95%可信区间计算获得的常数。

,。

根据所受照射剂量不同一般每个标本需分析500~2000个中期分裂相

7.3检测染色体易位率和95%可信区间的计算

():

检测染色体易位率的计算按照公式计算

5

x

…………()

F=5

p

n

式中:

Fp———检测到的染色体易位率;

x———检测到的染色体易位数;

n———观察细胞数。

():

检测染色体易位率的可信区间按照式计算

95%6

…………()

F1.96S6

p±p

式中:

F———检测到的染色体易位率;

p

———可信区间的值;

1.9695%u

———,():

检测染色体易位率的标准误按照式计算

S7

p

x

…………()

S=7

p

n

式中:

S———检测染色体易位率的标准误;ㅤㅤㅤㅤ

p

x———检测到的染色体易位数;

n———观察细胞数。

7.4剂量估算

将所要估算剂量的标本中得到的全基因组易位率及95%可信区间的上下限代入建立的剂量效应

,()。

曲线就可以估算出受照剂量见附录E

8质量控制

,,

进行荧光原位杂交的实验室应有名以上专业技术人员经严格训练掌握电离辐射生物效应的

8.12

,,。

基础知识应具有细胞遗传学的基本知识熟练掌握荧光原位杂交技术和识别易位染色体畸变为减少

,。

分析判定结果的差异应统一判定标准

。

8.2进行荧光原位杂交的实验室应通过国家计量认证或国家实验室认可开展荧光原位杂交的实验

室的条件和必备的仪器设备见附录E。

;、

进行剂量估算的实验室应建立自己的剂量效应曲线有条件的实验室可不同辐射类型不同剂量

8.3-

()。

率低LET辐射的剂量效应曲线

,;、

8.4剂量估算只能在曲线剂量范围内应用不得外推应考虑被分析人员的年龄吸烟等因素对结果的

影响。

、。

8.5标本应统一编号统一保存

、,

8.6实验过程中应有染色体标本质量检测杂交前变性标本质量检测记录以确保在每一步关键步骤

前的标本质量。

6

/—

GBZT2492014

附录

A

()

资料性附录

主要仪器设备和试剂配制

A.1主要仪器设备

:。

A.1.137℃恒温箱用于细胞培养和杂交

:,。

A.1.2普通离心机水平式离心机用于收获细胞

:。

A.1.3相差显微镜用于观察染色体制片的效果

:,,、、。

恒温水浴箱至少个温度可调室温用于低渗探针和标本的变性洗脱

A.1.42~80℃

:,,。

A.1.5恒温电热板温度可调温度范围在室温~90℃用于载玻片标本的加热

:,。

A.1.6混旋振荡器速度可调用于样品的混匀

:。

A.1.7小型离心机用于0.5mL~2mL小试管中样品的离心

:(,、)(

A.1.8冰箱低温冰箱-20℃用于贮存配好的试剂和血清复染后标本保存和普通冰箱用于贮存

少量实验用试剂)。

:,,、

荧光显微镜用于荧光原位杂交标本的显微分析至少配有种滤光片如或

A.1.92DAPIFITC

;;。

或者用于观察和荧光的滤光片也可以用同时可观察种荧光信号的滤光片最好配有

C3PIFITC2

y

数码相机或冷CCD的数字化染色体图像分析系统。

:,,。

湿盒用于杂交标本的保温能避光保持一定的湿度

A.1.10ㅤㅤㅤㅤ

A.2主要试剂的配制

A.2.1RPMI1640全培养基:培养基中含有粉末、无水碳酸

1LRPMI164010.4RPMI16401.3

g