T/CVDA 4-2022 动物中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体检测技术

ICS11.220

B41

T/CVDA

团体标准

T/CVDA4—2022

动物中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体检

测技术

DetectingtechniqueofneutralizationantibodyagainstMERS-CoVinanimals

2022-07-19发布2022-07-25实施

中国兽药协会发布

T/CVDA4—2022

目次

前言II

1范围1

2规范性引用文件1

3缩略语1

4试剂和材料1

5器材和设备2

5.1器材2

5.2设备2

6.动物血清2

6.1样品采集2

6.2样品制备2

6.3样品处理2

7VNT试验操作2

7.1安全防护2

7.2材料准备3

7.3检测操作3

8结果观察与判定4

8.1染色结果观察4

8.2结果判定4

I

T/CVDA4—2022

前言

本标准按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由中国兽药协会提出并归口管理，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所起草。

本标准主要起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、宁夏大学、中牧实业股份有限公司。

本标准主要起草人：步志高，刘任强，温志远，山丹，龚振兴，张蕾，华荣虹，葛金英，王喜军，

王翀。

本标准为首次发布。

II

T/CVDA4—2022

动物中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体检测技术

1范围

本标准规定了用于动物东呼吸综合征病毒血清中和抗体定量测定的病毒中和试验（VNT）的实验操

作方法及结果判定标准。

本标准适用于动物血清中中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体的定性检测和定量测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则。

GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法。

GB19489—2008实验室生物安全通用要求。

GB14922-94：实验动物微生物学和寄生虫学检测等级（啮齿类和兔类）。

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

MERS：中东呼吸综合征（MiddleEastrespiratorysyndrome）；

VNT：病毒中和试验（viralneutralizationtest）；

BSL-2：生物安全2级实验室（BiosafetyLaboratoryLevel2）；

DMEM：细胞基础培养基（Dulbecco'sEagle’sMinimumEssentialMedium）；

PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate-BufferedSaline）；

TCID50：半数组织培养感染量（MedianTissueCultureInfectiveDose）；

VSV：水泡性口炎病毒（VesicularStomatitisVirus）；

eGFP：增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein）；

Sprotein：纤突蛋白（spikeprotein）。

4试剂和材料

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

4.1水：GB/T6682-2008，ddH2O。

4.2中东呼吸综合征冠状病毒抗体阴性血清，为利用ELISA和RT-PCR方法验证均为阴性的骆驼阴性血清

（由标制单位提供）。

4.3中东呼吸综合征冠状病毒抗体阳性血清，为rLa-MERSs重组新城疫病毒两次免疫骆驼2w后收集的阳

性血清（由标制单位提供）。

4.4稀释用DMEM（见A.1）。

4.5细胞培养用DMEM（见A.2）。

4.6细胞培养用抗生素溶液（见A.3）。

4.7VeroE6细胞（由标制单位提供）。

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4.8重组水泡性口炎病毒毒株VSVΔG-MERSs-eGFP（由标制单位提供）：以水泡性口炎病毒Indiana毒株

5.0

为载体，缺失自身G蛋白，同时表达中东呼吸综合征病毒S蛋白和eGFP，滴度应≥10TCID50/mL。

5器材和设备

5.1器材

5.1.18道移液器50μL~200μL（±2%）。

5.1.2细胞培养板：96孔微量平底培养板。

5.1.3细胞计数器。

5.1.4U型底96孔板。

5.1.5细胞培养瓶离心管（1.5mL，15mL，50mL）；吸头（20μL~200μL）。

5.2设备

5.2.1恒温培养箱：37℃5%二氧化碳培养箱。

5.2.2显微镜：倒置荧光显微镜。

5.2.3冰箱：普通冰箱和超低温冰箱。

5.2.4BSL-2级生物安全柜。

5.2.5离心机。

5.2.6恒温水浴箱。

6.动物血清

6.1样品采集

动物血清采集时应做好个人防护（带N95口罩、手套，穿生物安全防护服），配备含75%酒精、碘

伏、止血绷带的应急处理箱。

6.2样品制备

无菌静脉采集动物血液不少于2mL，37℃静置60min。4℃放置1h至过夜后，6000r/min离心5min，

收集上清，-20℃以下保存待检。样品采集应详细记录相关信息。

6.3样品处理

采集和制备血清中的废弃物应置于生物安全垃圾袋内，集中高压处理。

7VNT试验操作

7.1安全防护

本检测应在满足GB19489-2008的BSL-2级生物安全实验室内进行。进行本检测的人员应采取针对

2

T/CVDA4—2022

性防护措施（佩戴口罩、手套、着长袖工作服）。废弃病毒液应弃于0.1%氢氧化钠溶液中。

7.2材料准备

7.2.1细胞

VeroE6细胞按照常规方法，用含10%胎牛血清的DMEM液培养基在37℃5%二氧化碳培养箱中

培养。1个75cm2的细胞培养瓶（15mL培养液）细胞刚长成单层后（4×106个/mL），可用于4块

96孔（细胞数为1×104个/孔）细胞培养板的检测。

7.2.2检测用培养板

以96孔细胞培养板进行检测。提前16~24h将VeroE6细胞铺在96孔板中，长成单层备用。

7.2.3血清灭活

SPF级小鼠免疫中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白，三次免疫后无菌采血，制备阳性血清。未免疫

SPF