DB33/T 2492-2022 虾肝肠胞虫核酸检测技术规范

ICS65.020.30

CCSB41

33

浙江省地方标准

DB33/T2492—2022

虾肝肠胞虫核酸检测技术规范

TechnicalspecificationfornucleicaciddetectionofEnterocytozoon

hepatopenaei

2022-05-17发布2022-06-17实施

浙江省市场监督管理局发布

DB33/T2492—2022

前言

本标准按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别专利的责任。

本标准由浙江省农业农村厅提出并组织实施。

本标准由浙江省水产标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：浙江省水产技术推广总站、浙江省休闲观赏渔业行业协会、杭州市农业技术推广

中心。

本标准主要起草人：朱凝瑜、郑晓叶、梁倩蓉、叶键、黄家庆、周凡、许婷、丁雪燕、吴洪喜。

I

DB33/T2492—2022

虾肝肠胞虫核酸检测技术规范

1范围

本标准规定了虾肝肠胞虫（Enterocytozoonhepatopenaei，EHP）套式PCR检测、荧光定量PCR检测、

环介导等温扩增（LAMP）检测方法所需试剂和材料、仪器和设备，样品采集、样品前处理、操作步骤和

结果判定。

本标准适用于虾类、饵料生物、养殖水体等样品中虾肝肠胞虫的检测和监测，其他甲壳类和浮游动

物参照执行。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

标准。

SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范

3术语和定义

本标准没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本标准

BstDNA聚合酶：嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶（BacillusstearothermophilusDNApolymerase）

bp：碱基对（basepair）

Ct值：反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（cyclethreshold）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

EHP：虾肝肠胞虫（Enterocytozoonheppenatoaei）

LAMP：环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification）

PCR：聚合酶链反应（polymerasechainreaction）

PEG：聚乙二醇（polyethyleneglycol）

SWP：孢子壁蛋白（sporewallprotein）

SYBRGreenIqPCRMix：含双链嵌合荧光染色剂的荧光定量PCR预混液

5试剂和材料

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

1

DB33/T2492—2022

5.1无水乙醇。

5.295%乙醇：95mL无水乙醇，加水定容至100mL。

5.370%乙醇：70mL无水乙醇，加水定容至100mL。

5.40.45μm硝酸纤维素膜。

5.53%牛肉膏洗脱液：30.0g牛肉浸膏加水溶解，调节pH至9.0，定容至1000mL，高压灭菌15min，

室温保存。

5.616%PEG8000：160.0gPEG8000、17.5gNaCl加水溶解，定容至1000mL，高压灭菌15min，室温

保存。

5.7磷酸氢二钠(Na2HPO4）（0.2mol/L）：71.6gNa2HPO4·12H2O加水溶解，调节pH至9.0，定容至1

000mL，高压灭菌15min，室温保存。

5.8抽提缓冲液：1mL1mol/LTris·HCl(pH8.0)、20mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)、2mL1mg/mL胰RNA

酶、5mL10%SDS加水溶解，定容至100mL，室温贮存。

5.9蛋白酶K（20mg/mL）：-20℃保存。

5.10This平衡酚（饱和酚）、10mol/L乙酸铵、酚/三氯甲烷/异戊醇（25:24:1）、三氯甲烷/异戊

醇（24:1）。

5.11TE缓冲液：10mL1mol/LTris·HCl(pH8.0)、2mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）加水定容至1000mL，

高压灭菌后4℃保存。

5.12TaqDNA聚合酶（5U/μL）：-20℃保存，避免反复冻融。

5.1310×PCR缓冲液：随TaqDNA聚合酶提供，-20℃保存。

5.14氯化镁（MgCl2）溶液（25mmol/L）：-20℃保存。

5.15dNTP：生化试剂，含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L的混合物，-20℃保存。

5.16套式PCR引物：两对引物（F514和R514、F147和R147）序列及其在靶基因中的位置见附录A

中的A.1，-20℃保存。

5.171×TAE电泳缓冲液：242gTris、100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)、57.1mL冰乙酸，加水定容至1

000mL，室温保存，使用时稀释50倍。

5.18琼脂糖：电泳级。

5.19样品缓冲液：40g蔗糖加水溶解，定容至1000mL，加入0.25g溴酚蓝溶解后，4℃保存。

5.20电泳核酸染料：溴化乙锭或4SGreen等商品化染料。

5.21DNAMarker2000，-20℃保存。

5.22SYBRGreenIqPCRMix。

5.23荧光定量PCR引物：引物（F118和R118）序列及其在靶基因中的位置见附录A中的A.2，-20℃

保存。

5.2410×thermolPol缓冲液：含200mmol/LTris·HCl(pH8.0)、100mmol/L硫酸铵（（NH4）2SO4）、

100