LY/T 1772-2008 杨树品种分子鉴定实验方法 DNA扩增片段长度多态性法(AFLP)

犐犆犛６５．０２０

犅６１

中华人民共和国林业行业标准

／—

犔犢犜１７７２２００８

杨树品种分子鉴定实验方法

扩增片段长度多态性法（）

犇犖犃犃犉犔犘

ㅤㅤㅤㅤ

—

犕狅犾犲犮狌犾犪狉犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉狏犪狉犻犲狋犻犲狊狅犳狅犾犪狉

狆狆

（）

犃犿犾犻犳犻犲犱犳狉犪犿犲狀狋犾犲狀狋犺狅犾犿狅狉犺犻狊犿犃犉犔犘

狆犵犵狆狔狆

２００８０９０３发布２００８１２０１实施

国家林业局发布

／—

犔犢犜１７７２２００８

杨树品种分子鉴定实验方法

扩增片段长度多态性法（）

犇犖犃犃犉犔犘

１范围

本标准规定了以杨树新鲜组织（叶片、芽等）为材料，利用扩增片段长度多态性法（

ＤＮＡＡｍｌｉｆｉｅｄ

ｐ

ＦｒａｍｅｎｔＬｅｎｔｈＰｏｌｍｏｒｈｉｓｍ，简称ＡＦＬＰ）对杨树品种进行分子鉴定的实验方法。

ｇｇｙｐ

本标准适用于杨树品种的分子鉴定。

２原理

杨树基因组ＤＮＡ经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机片段，将针对犈犮狅ＲＩ和

犕狊犲Ｉ的特定接头连接在这些ＤＮＡ片段的两端，形成带特异接头的ＤＮＡ片段，随后利用一对与接头和

邻接酶切位点相匹配的引物进行扩增，最终通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些特异性片段分离开来，

通过比较待测品种和对照品种间ＤＮＡ指纹谱带数据的差异，来判定待测品种与对照品种是否为相同

品种。

３仪器和设备

３．１通用实验室仪器设备。

３．２梯度ＰＣＲ扩增仪。ㅤㅤㅤㅤ

３．３琼脂糖胶电泳系统。

３．４变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统。

３．５紫外透射仪。

３．６凝胶成像系统或照相系统。

３．７重蒸馏水仪。

４试剂与溶液

除非另有说明，在分析中使用分析纯试剂。配制好的溶液经高压灭菌后使用。实验中所使用的水

均为无菌超纯水。

４．１犇犖犃限制性内切酶和（／）及其反应缓冲液

犈犮狅犚犐犕狊犲犐１０犝犔１０×

μ

－２０℃保存。

聚合酶（／）及其反应缓冲液

４．２犜犪犇犖犃１犝犔１０×犘犆犚

狇μ

反应缓冲液含／（）、／氯化镁（）和

１０×ＰＣＲ２００ｍｍｏｌＬＴｒｉｓＨＣｌＨ８．４１５ｍｍｏｌＬＭＣｌ

ｐｇ２

／氯化钾（），保存。

５００ｍｍｏｌＬＫＣｌ－２０℃

４．３犜连接酶（／）及其连接反应缓冲液

犇犖犃１犝犔１０×

４μ

反应缓冲液含／（）、／和／和

１０×３５０ｍｍｏｌＬＴｒｉｓＨＣｌＨ７．６５０ｍｍｏｌＬＭＣｌ５００ｍｍｏｌＬＫＣｌ

ｐｇ２

／巯基乙醇；保存。

５ｍｍｏｌＬβ－２０℃

四种脱氧核糖核苷酸（，，，）混合溶液（各／）

４．４犱犃犜犘犱犆犜犘犱犌犜犘犱犜犜犘１０犿犿狅犾犔

－２０℃保存。

分子量标记（）

４．５犇犖犃犇犖犃犕狅犾犲犮狌犾犪狉犠犲犻犺狋犕犪狉犽犲狉

犵

和，保存。

λＤＮＡＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００－２０℃

１

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犔犢犜１７７２２００８

／（）

４．６１犿狅犾犔犜狉犻狊犎犆犾犎８．０

狆

称取三羟甲基氨基甲烷（）溶解于水中，用浓盐酸调（下）至，用水

１２１．１ｇＴｒｉｓ８００ｍＬｐＨ２５℃８．０

定容至，分装，高压灭菌，室温保存。

１Ｌ１００ｍＬ

／（乙二胺四乙酸）溶液（）

４．７５００犿犿狅犾犔犈犇犜犃犎８．０

狆

将乙二胺四乙酸二钠（·）溶于水中，在磁力搅拌器上剧烈搅动，

１８６．１ｇＮａＥＤＴＡ２ＨＯ８００ｍＬ

２２

先用氢氧化钠（）颗粒（约）调接近，再用／溶液调至，用水定

ＮａＯＨ２０ｇｐＨ８．０１０ｍｏｌＬＮａＯＨｐＨ８．０

容至１Ｌ，分装后高压灭菌，室温保存。

／溴化乙锭（）溶液

４．８０．５犿犿犔犈犅

犵

称取，用水溶解，用铝箔或黑纸包裹容器，室温储存，工作浓度为／，每

１００ｍＥＢ２００ｍＬ０．５ｍＬ

ｇｇ

毫升电泳缓冲液中加１ＬＥＢ。

μ

／氢氧化钠（）溶液

４．９１０犿狅犾犔犖犪犗犎

称取８０ＮａＯＨ，先用１６０ｍＬ水溶解后，再加水定容至２００ｍＬ，高压灭菌，室温保存。

ｇ

／氯化钠（）溶液

４．１０５犿狅犾犔犖犪犆犾

溶解２９．２ＮａＣｌ于足量的水中，定容至１００ｍＬ，高压灭菌，室温保存。

ｇ

４．１１犆犜犃犅提取缓冲液

提取缓冲液的成分为（质量浓度）溴代十六烷基三甲胺（）、／

ＣＴＡＢ２％ＣＴＡＢ１００ｍｍｏｌＬＴｒｉｓ

、／（）、／、（质量浓度）聚乙烯基吡咯烷酮（）和

ＨＣｌ２０ｍｍｏｌＬＥＤＴＡＨ８．０１．４ｍｏｌＬＮａＣｌ０．５％ＰＶＰ

ｐ

（质量浓度）巯基乙醇（用前加入）。在去离子水中，加入、、

０．２％８００ｍＬ４６．７５ＮａＣｌ２ＣＴＡＢ０．５

βｇｇｇ

，搅动溶解后，加入／（）、／（）、

ＰＶＰ１０ｍＬ１ｍｍｏｌＬＴｒｉｓＨＣｌＨ８．０５００ｍｍｏｌＬＥＤＴＡＨ８．０４ｍＬ

ｐｐ

水和巯基乙醇（用前加入）。

３６ｍＬ２ｍＬ

β

／乙酸钠（·）（）

４．１２３犿狅犾犔犖犪犃犮３犎犗犎５．２

２狆

ㅤㅤㅤㅤ

取·溶于约水中，用冰乙酸（）调溶液的至，再加水

４０．８ＮａＡｃ３ＨＯ９０ｍＬＣＨＣＯＯＨＨ５．２

ｇ２３ｐ

定容到１００ｍＬ，高压灭菌后室温保存。

／乙酸钾（）

４．１３５犿狅犾犔犓犃犮

取４９．１ＫＡｃ溶解于足量的水中，加水定容到１００ｍＬ，室温保存。

ｇ

（体积比）三氯甲烷异戊醇

４．１４２４∶１

将９６ｍＬ三氯甲烷和４ｍＬ异戊醇混匀后，室温保存。

４．１５７０％（体积分数）乙醇

７０ｍＬ无水乙醇加入３０ｍＬ水，室温保存。

４．１６犜犈缓冲液（犎８．０）

狆

取／（），／（），用水定容至，

１ｍｍｏｌＬＴｒｉｓＨＣｌＨ８．０１ｍＬ５００ｍｍｏｌＬＥＤＴＡＨ８．００．２ｍＬ１００ｍＬ

ｐｐ

高压灭菌，室温保存。

／胰酶（）

４．１７１０犿犿犔犚犖犃犚犖犪狊犲犃

犵

称取，溶于缓冲液中，水浴（），缓慢冷却至室温，分

１ｍＲＮａｓｅＡ１００ＬＴＥ１００℃１０ｍｉｎ１０Ｌ

ｇμμ

装，保存。

－２０℃

电泳缓冲液（）

４．１８犜犃犈５０×

称取碱，加入的冰乙酸（／）、的／溶液

２４２Ｔｒｉｓ５７．１ｍＬ１７．４ｍｏｌＬ２００ｍＬ５００ｍｍｏｌＬＥＤＴＡ

ｇ

（），用水定容至，分装，高压灭菌，保存。

ｐＨ８．０１Ｌ１００ｍＬ４℃

电泳缓冲液（）

４．１９犜犅犈１０×

称取碱和硼酸，溶于适量水中，加入／溶液（），用

１０８Ｔｒｉｓ５５４０ｍＬ５００ｍｍｏｌＬＥＤＴＡＨ８．０

ｇｇｐ

水定容至，分装，高压灭菌，保存。

１Ｌ１００ｍＬ４℃

４．２００．８％琼脂糖凝胶的配制

称取０．８电泳级琼脂糖置于三角瓶中，加入（或）电泳缓冲液中，在

ｇ２００ｍＬ１００ｍＬ１×ＴＡＥＴＢＥ

２

／—

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微波炉中熔化至溶液透明（确保所有琼脂糖颗粒均完全熔化），冷却至５０℃６０℃，加入ＥＢ

～

（／）溶液使其终浓度为／（也可不把加入凝胶中，而是电泳后再用／的

１０ｍｍＬ０．５ｍＬＥＢ０．５ｍＬ

ｇμｇ