LY/T 1772-2008 杨树品种分子鉴定实验方法 DNA扩增片段长度多态性法(AFLP)
LY/T 1772-2008 Molecular identification method for varieties of poplar—Amplified fragment length polymorphism (AFLP)
基本信息
本标准适用于杨树品种的分子鉴定。
发布历史
-
2008年09月
研制信息
- 起草单位:
- 中国林业科学研究院林业研究所、中国科学院遗传与发育生物学研究所、国家林业局北方林木种子检验中心
- 起草人:
- 李金花、张绮纹、王斌、宋红竹、周春江、卢孟柱、李庆梅、牛正田
- 出版信息:
- 页数:16页 | 字数:18 千字 | 开本: 大16开
内容描述
犐犆犛65.020
犅61
中华人民共和国林业行业标准
/—
犔犢犜17722008
杨树品种分子鉴定实验方法
扩增片段长度多态性法()
犇犖犃犃犉犔犘
ㅤㅤㅤㅤ
—
犕狅犾犲犮狌犾犪狉犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉狏犪狉犻犲狋犻犲狊狅犳狅犾犪狉
狆狆
()
犃犿犾犻犳犻犲犱犳狉犪犿犲狀狋犾犲狀狋犺狅犾犿狅狉犺犻狊犿犃犉犔犘
狆犵犵狆狔狆
20080903发布20081201实施
国家林业局发布
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犔犢犜17722008
杨树品种分子鉴定实验方法
扩增片段长度多态性法()
犇犖犃犃犉犔犘
1范围
本标准规定了以杨树新鲜组织(叶片、芽等)为材料,利用扩增片段长度多态性法(
DNAAmlified
p
FramentLenthPolmorhism,简称AFLP)对杨树品种进行分子鉴定的实验方法。
ggyp
本标准适用于杨树品种的分子鉴定。
2原理
杨树基因组DNA经限制性内切酶双酶切后,形成分子量大小不等的随机片段,将针对犈犮狅RI和
犕狊犲I的特定接头连接在这些DNA片段的两端,形成带特异接头的DNA片段,随后利用一对与接头和
邻接酶切位点相匹配的引物进行扩增,最终通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些特异性片段分离开来,
通过比较待测品种和对照品种间DNA指纹谱带数据的差异,来判定待测品种与对照品种是否为相同
品种。
3仪器和设备
3.1通用实验室仪器设备。
3.2梯度PCR扩增仪。ㅤㅤㅤㅤ
3.3琼脂糖胶电泳系统。
3.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统。
3.5紫外透射仪。
3.6凝胶成像系统或照相系统。
3.7重蒸馏水仪。
4试剂与溶液
除非另有说明,在分析中使用分析纯试剂。配制好的溶液经高压灭菌后使用。实验中所使用的水
均为无菌超纯水。
4.1犇犖犃限制性内切酶和(/)及其反应缓冲液
犈犮狅犚犐犕狊犲犐10犝犔10×
μ
-20℃保存。
聚合酶(/)及其反应缓冲液
4.2犜犪犇犖犃1犝犔10×犘犆犚
狇μ
反应缓冲液含/()、/氯化镁()和
10×PCR200mmolLTrisHClH8.415mmolLMCl
pg2
/氯化钾(),保存。
500mmolLKCl-20℃
4.3犜连接酶(/)及其连接反应缓冲液
犇犖犃1犝犔10×
4μ
反应缓冲液含/()、/和/和
10×350mmolLTrisHClH7.650mmolLMCl500mmolLKCl
pg2
/巯基乙醇;保存。
5mmolLβ-20℃
四种脱氧核糖核苷酸(,,,)混合溶液(各/)
4.4犱犃犜犘犱犆犜犘犱犌犜犘犱犜犜犘10犿犿狅犾犔
-20℃保存。
分子量标记()
4.5犇犖犃犇犖犃犕狅犾犲犮狌犾犪狉犠犲犻犺狋犕犪狉犽犲狉
犵
和,保存。
λDNADNAMarkerDL2000-20℃
1
/—
犔犢犜17722008
/()
4.61犿狅犾犔犜狉犻狊犎犆犾犎8.0
狆
称取三羟甲基氨基甲烷()溶解于水中,用浓盐酸调(下)至,用水
121.1gTris800mLpH25℃8.0
定容至,分装,高压灭菌,室温保存。
1L100mL
/(乙二胺四乙酸)溶液()
4.7500犿犿狅犾犔犈犇犜犃犎8.0
狆
将乙二胺四乙酸二钠(·)溶于水中,在磁力搅拌器上剧烈搅动,
186.1gNaEDTA2HO800mL
22
先用氢氧化钠()颗粒(约)调接近,再用/溶液调至,用水定
NaOH20gpH8.010molLNaOHpH8.0
容至1L,分装后高压灭菌,室温保存。
/溴化乙锭()溶液
4.80.5犿犿犔犈犅
犵
称取,用水溶解,用铝箔或黑纸包裹容器,室温储存,工作浓度为/,每
100mEB200mL0.5mL
gg
毫升电泳缓冲液中加1LEB。
μ
/氢氧化钠()溶液
4.910犿狅犾犔犖犪犗犎
称取80NaOH,先用160mL水溶解后,再加水定容至200mL,高压灭菌,室温保存。
g
/氯化钠()溶液
4.105犿狅犾犔犖犪犆犾
溶解29.2NaCl于足量的水中,定容至100mL,高压灭菌,室温保存。
g
4.11犆犜犃犅提取缓冲液
提取缓冲液的成分为(质量浓度)溴代十六烷基三甲胺()、/
CTAB2%CTAB100mmolLTris
、/()、/、(质量浓度)聚乙烯基吡咯烷酮()和
HCl20mmolLEDTAH8.01.4molLNaCl0.5%PVP
p
(质量浓度)巯基乙醇(用前加入)。在去离子水中,加入、、
0.2%800mL46.75NaCl2CTAB0.5
βggg
,搅动溶解后,加入/()、/()、
PVP10mL1mmolLTrisHClH8.0500mmolLEDTAH8.04mL
pp
水和巯基乙醇(用前加入)。
36mL2mL
β
/乙酸钠(·)()
4.123犿狅犾犔犖犪犃犮3犎犗犎5.2
2狆
ㅤㅤㅤㅤ
取·溶于约水中,用冰乙酸()调溶液的至,再加水
40.8NaAc3HO90mLCHCOOHH5.2
g23p
定容到100mL,高压灭菌后室温保存。
/乙酸钾()
4.135犿狅犾犔犓犃犮
取49.1KAc溶解于足量的水中,加水定容到100mL,室温保存。
g
(体积比)三氯甲烷异戊醇
4.1424∶1
将96mL三氯甲烷和4mL异戊醇混匀后,室温保存。
4.1570%(体积分数)乙醇
70mL无水乙醇加入30mL水,室温保存。
4.16犜犈缓冲液(犎8.0)
狆
取/(),/(),用水定容至,
1mmolLTrisHClH8.01mL500mmolLEDTAH8.00.2mL100mL
pp
高压灭菌,室温保存。
/胰酶()
4.1710犿犿犔犚犖犃犚犖犪狊犲犃
犵
称取,溶于缓冲液中,水浴(),缓慢冷却至室温,分
1mRNaseA100LTE100℃10min10L
gμμ
装,保存。
-20℃
电泳缓冲液()
4.18犜犃犈50×
称取碱,加入的冰乙酸(/)、的/溶液
242Tris57.1mL17.4molL200mL500mmolLEDTA
g
(),用水定容至,分装,高压灭菌,保存。
pH8.01L100mL4℃
电泳缓冲液()
4.19犜犅犈10×
称取碱和硼酸,溶于适量水中,加入/溶液(),用
108Tris5540mL500mmolLEDTAH8.0
ggp
水定容至,分装,高压灭菌,保存。
1L100mL4℃
4.200.8%琼脂糖凝胶的配制
称取0.8电泳级琼脂糖置于三角瓶中,加入(或)电泳缓冲液中,在
g200mL100mL1×TAETBE
2
/—
犔犢犜17722008
微波炉中熔化至溶液透明(确保所有琼脂糖颗粒均完全熔化),冷却至50℃60℃,加入EB
~
(/)溶液使其终浓度为/(也可不把加入凝胶中,而是电泳后再用/的
10mmL0.5mLEB0.5mL
gμg
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