GB/T 18649-2014 牛传染性胸膜肺炎诊断技术

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B41

中华人民共和国国彖标准

GB/T18649—2014

代替GB/T18649—2002

牛传染性胸膜肺炎诊断技术

Diagnostictechniquesofcontagiousbovinepleuropneumonia

2014-09-30发布2015-03-01实施

GB/T18649—2014

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本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准代替GB/T18649—2002((牛传染性胸膜肺炎(牛肺疫)诊断技术》。本标准与GB/T18649-

2002相比，主要技术变化如下：

——删除了其中的微量凝集试验；

——修改了其中的补体结合试验；

——增加了聚合酶链式反应(PCR)检测方法和C-ELISA检测方法。

本标准由中华人民共和国农业部提出"

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。

本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

本标准主要起草人:辛九庆、李媛。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

——GB/T18649—2002o

T

GB/T18649—2014

牛传染性胸膜肺炎诊断技术

1范围

本标准规定了牛传染性胸膜肺炎的病原学检查、聚合酶链式反应(PCR)、补体结合试验、竞争

ELISA(C-ELISA)试验诊断技术要求。病原学检查和聚合酶链式反应(PCR)适用于急性、亚急性及慢

性病牛的病原诊断,补体结合试验和竞争ELISA(C-ELISA)试验适用于牛传染性胸膜肺炎感染牛的抗

体检测。

本标准适用于口岸、产地及集散地、养殖企业或养殖户对牛传染性胸膜肺炎的诊断。

2流行病学

健康牛和病牛接触，由呼吸道吸入病牛的“飞沫”是本病的主要传染途径。在该病的常在地区多见

亚急性和慢性病程，以地方流行性为特点。但在新发生本病地区以急性经过为主。慢性病牛长期带菌，

成为隐蔽的传染源。

3临床症状

暴发流行时多呈急性病程,体温在41匸以上稽留。呼吸系统症状非常明显，表现为：呼吸困难，呈

腹式呼吸，咳嗽弱而无力，有浆液或脓性鼻汁流出。食欲废绝。

4病理变化

急性期病变以浆液渗岀性纤维素性胸膜肺炎，间质多孔多汁,肺小叶出现各期肝变、多色，呈大理石

样肺，肺胸膜和肋胸膜粘连，以及胸腔渗出液大量潴留为特征。转为慢性后逐渐形成肺包膜或坏死块。

5病原分离鉴定

5.1材料准备

10%马血清马丁肉汤和琼脂培养基:见附录A。

5.2病料采集

用灭菌器械(注射器、剪刀、青霉素瓶、棉拭子等)无菌采集关节液、胸腔积液、鼻腔拭子和全血，关节

液和胸腔渗出液置于青霉素瓶内。

5.3病料的保存

病料均放入4°C冰箱内保存，并在24h内送到指定实验室。如果在24h内不能送达，应放入

-20°C冰箱内保存。

5.4培养方法

在无菌条件下吸取胸腔渗出液或关节液0.1mL〜0.3mL接种于培养基中即可。鼻腔拭子用

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5mL灭菌生理盐水（含有100U/mL青霉素）浸泡15min后，吸取0.1mL~0.3mL接种于培养基中

即可。

5.5结果判定

5.5.1培养特征

5.5.1.1培养性状和菌落形态

牛传染性胸膜肺炎病原在10%马血清马丁肉汤内生长初期呈轻微浑浊或呈白色点状、丝状生长，

以后逐渐均匀混浊，半透明稍带乳光，不产生菌膜或沉淀，也无颗粒悬浮。在含有10%马血清的马丁琼

脂培养基上生长迟缓，为极小的水滴状圆形略带灰色的微小菌落，中央有乳头状突起。菌落直径约

0.2〜0.5,肉眼不易看见，需用放大镜或低倍显微镜观察。

5.5.1.2染色镜检

取马丁肉汤培养物涂片置于温箱中干燥后在酒精灯上轻微火焰固定，再用3%〜5%饼酸蒸憾水溶

液固定1min〜2min,水洗,浸入用蒸憎水稀释的1:30姬姆萨氏染液中染色，染液缸放入普通冰箱内

过夜。染色后取岀用蒸憾水清洗，自然干燥后用800倍〜1000倍显微镜观察。菌型为多形态，以球点

形最常见，大小在125n〜250no

5.5.2生化特征

5.5.2.1糖发酵试验

在进行糖发酵试验时，将各种糖培养基管（见附录B）加无菌的马血清0.2mL,再加被检菌液

0.1mL置37°C下培养5d〜7do

结果判定：丝状支原体丝状亚种SC型可轻度分解葡萄糖、麦芽糖、糊精、淀粉，产酸，使培养基变

黄，而不产气;不能分解果糖、蕈糖、半乳糖和水杨昔。

5.5.2.2硫化氢（H2S）试验

将被检菌液接种于10%马血清马丁肉汤或琼脂斜面上，取一片乙酸铅滤纸条（见附录C）,夹在试

管的棉塞下悬挂，置37°C培养5d〜7d,滤纸条变黑或棕褐色为阳性反应。

5.5.2.3硝酸盐还原试验

向硝酸盐还原培养基（见附录D中D.1）中加10%无菌马血清，然后将被检菌液0.1mL接种于硝

酸盐还原培养基中，同时设不接种的对照，于37°C培养5d~7do于5d和7d时取1mL培养液置于

干净试管中，再各滴0.1mL试剂甲液和乙液（见D.2），对照管同样加试剂。

结果判定：若试管菌液呈现红色或橙色者为阳性反应；如无红色出现，则可加0.1mL二苯胺试剂，

若呈现蓝色反应，则表示培养基中有硝酸盐存在;如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐已被

还原成其他物质，则仍判定为硝酸盐还原试验阳性反应。

5.5.2.4靛基质试验

向靛基质试验培养基（见附录E中E.1）中加入10%无菌马血清,再将被检菌液0.1mL接种于培养

基中，37°C培养5d〜7d后，滴加试剂0.1mL于培养物液面，轻轻摇动，红色为阳性反应，黄色为阴性

反应。

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5.525甲基红(MR)试验

按10%的体积向甲基红(MR)试验培养基(见附录F中F.1)中加入无菌马血清，再接种被检菌液

0.1mL,37°C培养。于培养第五天时取1mL培养液于另一支试管中，并加0.1mL试剂，如培养液呈

现红色为MR试验阳性；黄色者为阴性，继续培养至第七天，再进行试验。

5.526维培二氏(V-P)试验

可用下列三种试剂进行V-P试验：

a)Barritt's试剂法

取被检菌液2mL力口甲液1mL、乙液0.4mL(见附录G中G.1),充分混合，在5min内呈粉红色反

应为阳性。

b)()，Meara's试剂法

取被检菌液2mL加等量试剂(见G.2)混合,充分振荡试剂，在5min内呈现粉红色者为阳性反应。

c)硫酸铜试剂法

取被检菌液2mL加等量硫酸铜试剂(见G.3)混合，充分振荡试剂，在5min内呈粉红色反应为

阳性。

上述三种方法为阴性，继续培养,再进行观察。

6聚合酶链式反应(PCR)

6.1材料与试剂

6.1.1引物。

6.1.1.1特异性引物：SC1和SC2为丝状支原体丝状亚种SC型(MSC)特异性引物。

6.1.1.2引物序列。

SC1：ATATACTTCTGTTCTAGTAATATG；

SC2:CTGATTATGATGACAGTGGTCA。

6.1.1.3引物浓度：浓度为5pmol/MLo

6.1.2Tag酶(5U/mL)o

6.1.3电泳缓冲液(TAE)0

6.1.4琼脂糖:浓度为1.5%。

6.1.5DNA分子质量标准。

6.2试验程序

6.2.1样品的采集与处理

6.2.1.1组织样品的采集

参照5.2进行。

6.2.1.2标准阳性样品的处理

用1mL马丁汤培养基(含10%马血清，不含抗生素)溶解冻干菌种后，加入9mL马丁汤内，混匀

后从中吸取1mL菌液加入到下一试管中，共稀释9管，另1管做空白对照。置于37°C培养箱内培养

7d〜10d,每日观察，待菌体个数达到每毫升10*颜色变化单位(colorchangeunit,CCU)时收获。

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6.2.2基因组DNA的提取

使用商品化的基因组DNA提取试剂盒，参照说明书进行操作。

6.2.3PCR反应

采用20卩L反应体系：

10X缓冲液2.0fiL

2.5ol/LdNTPs1.6[iL

10[imol引物11.0

10fzmol引物21.0[zL

模板DNA1.0[zL

10u/jzLTag酶0.5卩L

纯水12.9

总体积20.0卩L

瞬时离心，置PCR仪内进行PCR循环。95°C预变性3min；循环94°C45s,57°C45s,72°C

1min,35个循环后72°C延伸10min0采用常规方法配制的1.5%琼脂糖进行制板并电泳检测。

6.3PCR产物的判定

6.3.1标准阳性样品扩增出277bp片段而空白对照不能扩增出任何条带，则PCR反应判定为有效。

如标准阳性样品不能扩增出目的大小片段，或空白对照扩增出目的片段,则反应无效。

6.3.2在PCR反应有效的前提下，待检样品扩增出的DNA片段为277bp,可判定待检样品为阳性，否

则待检样品为阴性。

7补体结合试验

7.1材料准备

7.1.1试验用巴比妥缓冲液，使用时作1:5稀释，配制方法见附录H。

7.1.2绵羊红细胞悬液使用阿氏液，制备方法见附录Io

7.1.36%绵羊红细胞悬液制备见附录J。

7.1.4抗原、标准阳性血清、阴性血清采用国际标准品，溶血素由兽医生物药品厂供应，按说明书使用。

溶血素效价滴定见附录K。

7.1.5致敏绵羊红细胞制备:使用12单位HDm（50%溶血程度）的溶血素与等体积的6%绵羊红细胞

混合，37°C水浴30min,期间间隔5min摇动一次。

7.1.6补体效价滴定方法见附录L。

7.1.7抗原效价滴定方法见附录Mo

7.2操作方法

7.2.1被检血清、标准阴性血清、阳性血清均用巴比妥缓冲液作1:10稀释，于56°C水浴中灭活

30mino

7.2.2在96孔微量反应板中，每孔加入25卩L抗原、25yL被检血清、25ML2.5U补体，振荡混匀后

37°C水浴30min0

7.2.3每孔加入25卩L致敏后的绵羊红细胞，振荡混匀后37°C水浴30min。

7.2.4设标准阳性血清、阴性血清、补体对照、溶血素对照、红细胞对照以及抗原抗补体活性对照。具

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体试验步骤见表1。