DB32/T 3860-2020 玉米品种及纯度鉴定技术规程 SNP标记法

ICS65.020.20

B21

DB32

江苏省地方标准

DB32/T3860—2020

玉米品种及纯度鉴定技术规程SNP标记法

Technicalregulationforidentificationofmaizevarietiesandpurity—

SNPmarkermethod

2020-10-13发布2020-11-13实施

江苏省市场监督管理局发布

DB32/T3860—2020

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由江苏省农业科学院提出并归口。

本标准起草单位：江苏省农业科学院。

本标准主要起草人：赵涵、张体付、吕远大、陈艳萍、林峰、陆海燕、梁帅强。

I

DB32/T3860—2020

玉米品种及纯度鉴定技术规程SNP标记法

1范围

本标准规定了利用SNP（singlenucleotidepolymorphism）标记进行玉米品种及纯度鉴定的原理、仪

器设备及试剂、引物信息、操作步骤等要求。

本标准适用于玉米自交系、单交种及纯度的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

SNP标记singlenucleotidepolymorphismmarker

基于单核苷酸多态性的分子标记。

3.2

推荐引物recommendedprimer

品种鉴定中优先选用的一套SNP引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。

3.3

竞争性等位基因特异性PCR（KASP,KompetitiveAlleleSpecificPCR）

通过引物末端特异性碱基竞争性匹配DNA模板实现SNP基因分型的链式聚合酶反应。

3.4

品种纯度varietalpurity

品种在DNA分子标记基因分型方面一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占供检样品种子总

数的百分率表示。

1

DB32/T3860—2020

4原理

玉米基因组中普遍存在着单碱基的变异，不同品种同一SNP位点的基因型可利用适宜引物通过

KASP检出，进而根据SNP位点基因型的差异鉴定品种及纯度。

5仪器设备及试剂

见附录A。

6引物信息

见附录B。

7操作步骤

7.1样品DNA提取

7.1.1样品准备

试验样品种子的分样与保存，应符合GB/T3543.2的规定。

7.1.2用于品种鉴定样品DNA提取

从送检样品中随机抽取10粒种子发苗。分单株剪取100mg幼苗用液氮研磨，将研磨粉末转入2mL

离心管，加入0.5mL2×CTAB提取缓冲液充分混匀。在55℃～65℃恒浴30min。加入1mL氯仿:异戊

醇（24：1），充分摇动5min，8000g，室温下离心5min。取上清液加入0.6×体积异丙醇，室温下静

置30min，5000g，4℃离心5min。沉淀用0.8mL高盐缓冲液充分溶解，15000g离心2min。上清

加入0.6×体积异丙醇，室温下静置30min，5000g，4℃离心5min。沉淀用400µL双蒸水溶解，加

入2.5×体积95%的预冷乙醇，﹣20℃冰箱放置2h以上，15000g离心20min。用70%的预冷乙醇洗

一次，自然干燥后，用200μL0.1×TE缓冲液溶解，置4℃保存。

注：以上为推荐用于品种鉴定的DNA提取方法，其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法都适用于本标

准。

7.1.3用于纯度鉴定样品DNA提取

按GB/T3543.4规定的方法，从送检样品中抽取不少于100粒种子发苗。分单株剪取0.5cm～1cm

长的幼苗，放入96孔PCR板的孔中，每孔1株幼苗样品。每孔加入40μLDNA提取试剂盒Ⅰ缓冲液，

在沸水中煮沸30s，然后加入60μLDNA提取试剂盒Ⅱ缓冲液，在沸水中煮沸2min，置4℃保存，保

存不超过7d。

注：以上为推荐用于纯度鉴定的DNA提取方法，其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法都适用于本标

准。

7.2PCR扩增

7.2.1引物筛选

用于品种及纯度鉴定的40组推荐引物及其序列参见附录B。

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DB32/T3860—2020

自行筛选引物时，取送检杂交种及父、母本种子各5粒，通过KASP对一系列SNP分子标记引物

进行筛选，确定适宜的引物。适宜引物应为能够清晰区分杂交种及其父、母本的共显性引物。

7.2.2PCR反应体系

在5μL的反应体系中进行扩增。反应体系包含0.07μL引物KASPAssaymix，2.5μL2×KASP

Mastermix，50ng模板DNA。扩增反应条件为：PCR程序为94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃

退火和延伸60s，10个循环,每个循环降低0.6℃；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，26个循

环。反应利用96孔PCR板在PCR扩增仪上进行。

7.3基因分型检测

在微孔板荧光分析仪上读取荧光信号,使用荧光结果处理软件按照分型明确、NTC(无样品阴性对

照)无特异性扩增的原则进行样品SNP分型。

7.4数据采集与判定

7.4.1数据记录

纯合位点的基因型数据记录为X/X和Y/Y，其中X、Y为同一位点上两个不同的等位变异；杂合

位点的基因型数据记录为X/Y；缺失位点等位变异数据记录为-/-。

7.4.2品种鉴定的判定

根据送检样品在40个SNP位点基因型的差异进行品种鉴定，具体判定标准如下：

——差异位点数≥4，判定为不同品种；

——差异位点数≥1且≤3，判定为近似品种；

——差异位点数=0，判定为极近似或相同品种。

对利用附录B中40组引物仍未检测到≥4个差异位点数的样品，必要时可增加自行筛选引物进行

检测。

7.4.3纯度鉴定的判定

品种纯度按照下列公式计算：

品种纯度%（自交系）=（供检种子粒数-非本品种种子粒数）/供检种子粒数×100%

品种纯度%（单交种）=（供检种子粒数-母本种子粒数-其他类型种子粒数）/供检种子粒数×100%

3

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AA

附录A

（规范性附录）

仪器设备及试剂配制

A.1仪器设备

仪器设备包括：

——微孔板荧光分析仪；

——PCR扩增仪；

——电子天平（感量0.01g，0.001g）；

——冰箱；

——微量加样器（0.1µL～2.5µL,0.5µL～10µL,20µL～200µL,100µL～1000µL）；

——磁力搅拌器；

——高压灭菌锅；

——酸度计等；

——离心管