T/CI 011-2021 细菌生物被膜的培养、观测和耐药性评测技术指南

范围:本指南规定了细菌生物被膜培养、观测和耐药性评测技术的实验条件要求、实验设计、实施与验证等技术要求。本指南适用于研究机构、教育机构以及其他生物技术相关机构或公司内需培养、观测细菌生物被膜，并检测细菌生物被膜耐药性的实验操作人员阅读并参考使用。本指南亦适用于临床和食源性分离细菌菌株生物被膜形成能力的鉴定、临床和食源性分离菌株生物被膜耐药性的测定、细菌生物被膜形成和耐药分子机制的探究、细菌生物被膜防控方法及药物的研发等领域。 本指南可作为实验室细菌生物被膜培养与构建、观测与定量、以及耐药性评估等工作的技术依据。 根据《中华人民共和国专利法》，对于本指南中所涉及专利技术（US9988380B2，US10416153B2，ZL201711231930.8，CN110974838A）的使用，需获得专利权所有人书面许可; 主要技术内容:细菌生物被膜培养方法与技术标准以下生物被膜培养方法与技术标准均以铜绿假单胞菌为模式菌株撰写，其他菌种培养以及实验条件可按需求适当调整。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的革兰氏阴性条件致病菌，在正常人皮肤、呼吸道、肠道以及多种自然环境如水、土壤中广泛分布。此菌为杆状单鞭毛形态，适宜生长温度为25-37℃，在42℃也可生长，于LB培养基上呈青绿色圆形菌落且极易附着在不同基质表面形成生物被膜。铜绿假单胞菌是医院内感染的主要致病菌之一，可在免疫力低下的患者不同部位形成生物被膜引起长期慢性感染，包括烧伤伤口感染、呼吸道感染和尿路感染等，并可引发菌血症和败血症等致命并发症。此菌对多种抗生素耐药，并且耐药机制非常复杂，包括形成生物被膜、加强外排泵系统、改变细胞膜通透性与药物作用靶点、以及分泌抗菌酶等。铜绿假单胞菌生物被膜的形成机制也相当复杂，例如通过过量分泌胞外多糖、积累胞外DNA、降低运动能力、调节群体感应系统等。作为研究生物被膜的模式菌株，铜绿假单胞菌早已被广泛应用于构建生物被膜、检测其耐药性并开发用药方案的研究中，是以本指南以铜绿假单胞菌为模式菌株撰写，其他菌种的培养及实验条件可按需适当调整以达到最佳实验结果。4.1 体外静态生物被膜培养本指南囊括四种常用的体外静态生物被膜培养方法，包括孔板培养法、玻璃珠培养法、玻片培养法和Peg-lid培养法。（1）孔板培养法（4.1.1）将稀释菌液在96孔板或24孔板中培