GB/T 15356-1994 化学试剂 核苷酸测定通则

中华人民共和国国家标准

化学试剂GB/T15356一94

核。普酸观定通贝

Chemicalreagent

Generalrulesforthedeterminationofnucleotides

1主题内容与适用范围

本标准规定了化学试剂核昔酸含量、熔点、比旋光度、层析试验和干燥失重测定的通用方法。

本标准适用于化学试剂核昔酸及其衍生物的分析。

本标准不适用于药用核昔酸及其衍生物的分析。

2弓}用标准

GB/T601化学试剂滴定分析(容量分析)用标准溶液的制备

GB/T602化学试剂杂质测定用标准溶液的制备

GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备

GB/"I'613化学试剂比旋光度测定通用方法

GB/T617化学试剂熔点范围测定通用方法

GB/T6”化学试剂采样及验收规则

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T9008液相色谱法术语柱液相色谱法和平面色谱法

GB/T9721化学试剂分子吸收分光光度法通则(紫外和可见部分)

3一般规定

3.1本标准中所用的水、在没有注明其他要求时，应符合GB/T6682中三级水的规格。

3.2本标准中所用试剂的纯度应为分析纯。

3.3本标准中凡层析测定时，核普酸R，值均应以在完全相同条件下的对照样品的R，值为判断标准，

且每次测定都不得省去作为判断标准的对照样品。

3.4本标准中凡层析测定需作杂质限量检测时，应使用符合6.1.2.1条之规定的对照样品。

熔点测定

按GB/T617规定测定。

核昔酸的熔点数值可参考附录A(参考件)。

比旋光度的测定

按GB/T613之规定测定。

核昔酸的比旋光度数值可参考附录A(参考件)。

国家技术监督局1994一12一22批准1995一10一01实施

GB/T15356一94

6层析试验

层析试验用于检测核昔酸的纯度及定性鉴别。所有核昔酸均应以下列方法中选择一种方法进行测

定。

6.，纸层析

6.1.1方法原理

纸层析法是以a纸为惰性支持物的一种层析法。分离原理属分配层析的范畴，它利用不同溶质在静

止的水相，亦即纸上所吸附的水为固定相和沿纸流动的有机相(即流动相)两相溶剂的不断分配而达分

离的目的。核昔酸经层析后，常用比移值(凡)来表示各组分在层析谱中的位置。(凡)值按式(1)计算:

·····.，….…”.”.“，”。。”..…(1)

式中:R,—比移值;

d.-溶质迁移距离,cm;

dm—流动相迁移距离，cm.

在一定的条件下，同一核普酸的R。值是一定的。但由于影响R，值的因素较多，一般都采用与对照

样品对比，即根据样品与对照样品在层析谱中R，值来进行鉴别，并可在254nm的紫外灯下观察，以显

示出杂质斑点的多少和色量来确定样品的纯度。也可剪下斑点，溶于特定溶剂，用紫外分光光度计测定

吸光度，并计算样品的含量和杂质的含量。

6.1.2试剂及材料

6.1.2.1对照样品

纸层析和薄层层析所用的对照样品，主体含量不少于98.0%.

6.1-2.2层析用纸

层析用纸是指具有一定强度、质地均匀平整的纯棉浆制成的撼纸。纸的裁切方向应使流动相能顺着

纹理方向移动。.定性用的层析诊纸灰分须小于0.1%，一般可选用新华一号层析滤纸。

6.，.2.3展开剂

展开剂可参照附录B(参考件)之规定，使用前制备.

必要时可选用其他展开剂。

6.1.2.4展开室

可选用大小适宜的标本缸。

6.，.3操作步骤

取新华一号层析滤纸，长30cm，离底边2cm处用铅笔划一条直线，在直线两端2cm处开始点样，

点与点之间距离为2cm，点样扩散的直径不超过0.5cm.同一张层析纸上可点数个样品，纸的宽度取决

于样品的数目，井留有点对照样品的位置。

称取。.005g核昔酸样品，精确至0.0001g,溶于0.5mL水或盐酸溶液Cc(HCl)=0.01mol/L),

必要时稍微加热溶解。用微量进样器或徽量吸管点样，每次点样后须用冷风吹干，点样量按检测要求不

少于5uL，即相当于50fag样品。

核昔酸纸层析一般采用上行。将已吹干后的层析纸两边卷成图筒状，用二根塑料丝上下固定。在一

高为36cm的标本缸内平放一培养皿，内盛高度为。.5cm的展开剂，将层析纸置于缸内以展开剂的饱

和蒸气平衡2^-4h后，将样品端朝下放入培养皿中，盖紧玻璃盖。展开1216h,流动相前沿即可上升

2628cm,此时将层析纸取出晾干或在50℃干燥。

6.1.4观察吸收斑点

GB/T15356一94

将除去展开剂后的层析纸，在254ran的紫外灯下观察，即观察出紫外吸收斑点。

6.，.5结果的确定

6.1.5.1以50pg点样量，按规定展开并在紫外灯下观察，只观察出一个紫外吸收斑点，且与对照样品

的R，值一致，即可确定其层析试验为合格。

6.1.5.2以50lag点样量，按规定展开并在紫外灯下观察，除显示出一个斑点外，其他核昔酸的斑点小

于或等于按产品规格制备的杂质标准的斑点时，即可确定含其他核昔酸小于或等于标准。

6.2薄层层析

6.2.，方法原理

薄层层析是一种将吸附剂均匀地铺在一块玻璃板上形成一薄层，在此薄层上进行色层分离的一种

层析法，按分离机理可以分为吸附、分配、离子交换、凝胶过瘾等法。本标准主要使用吸附薄层层析法。

6.2.2试剂及材料

6.2.2.1对照样品

应符合6.1.2.1条之规定。

6.2.2.2硅胶GF

本品系白色均匀细粉及萤光粉，粒度平均在10^40Ajm之间，含有约13%的半水合硫酸钙。本品应

附合下列分离要求:各取。.040g二甲基黄、苏丹.、靛酚蓝，溶于100mL苯中。取2WL，点样于按

6.2.3.1条之规定制备的硅胶GF板上，用苯展开10cm，色谱图应显示三个清晰的分离斑点，靛酚蓝斑

点接近于起始点，二甲基黄在色谱图的中央，苏丹，介于二者之间。

6.2-2.3展开剂

通常选用正丁醇+丙酮+冰乙酸+500氨水+水=7+5+3十3+2(体积比)。必要时可选用其他展

开剂。可参照附录B(参考件)或其他文献。

6.2.3操作步骤

6.2.3.1制板

制备薄层板所用的玻璃板必需表面光滑，清洁，其大小可根据需要选择。小的可用载玻片，大的可裁

成20cmX20cm的玻璃片。

取一定量的吸附剂(硅胶GF可按25^30g加60^65mL水)在研钵中加水调成糊状，按玻璃板的

尺寸取一定量的吸附剂糊均匀地铺成一厚度为。.2-0.3mm的薄层。若使用涂铺器可按制造厂商推荐

的方法涂铺。铺成的薄层须置于水平台上室温干燥过夜。硅胶GF制板