GB/T 28630.3-2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第3部分：原位杂交检测法

ICS65.020.30

B41

中华人民共和国国家标准

/—

GBT28630.32012

白斑综合征()诊断规程

WSD

:

第部分原位杂交检测法

3

国家标准ㅤ可打印ㅤ可复制ㅤ无水印ㅤ高清原版ㅤ去除空白页

—

Dianosticrotocolsforwhitesotdisease

gpp

:

Part3Insituhbridizationmethod

y

2012-07-31发布2012-11-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

/—

GBT28630.32012

前言

/《()》:

GBT28630白斑综合征WSD诊断规程分为五个部分

———:;

第部分核酸探针斑点杂交检测法

1

———:;

第部分套式检测法

2PCR

———:;

第部分原位杂交检测法

3

———:;

第部分组织病理学诊断法

4

———:。

第部分新鲜组织的染色法

5T-E

本部分为/的第部分。

GBT286303

本部分按照/—给出的规则起草。

GBT1.12009

国家标准ㅤ可打印ㅤ可复制ㅤ无水印ㅤ高清原版ㅤ去除空白页

Ⅰ

/—

GBT28630.32012

白斑综合征()诊断规程

WSD

:

第部分原位杂交检测法

3

1范围

/、、

GBT28630的本部分规定了白斑综合征原位杂交检测法所需试剂与材料仪器设备操作步骤和

结果判定。

本部分适用于进行对虾及白斑综合征的其他敏感宿主组织细胞的感染程度及病毒扩增状况的评估

。。

和疾病的确诊不适于对病毒的非感染性携带的标本进行病毒检测

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文

。,()。

件凡不注日期的引用文件其最新版本包括所有修改单适用于本文件

/—():

白斑综合征诊断规程第部分核酸探针斑点杂交检测法

GBT28630.12012WSD1

/—():

白斑综合征诊断规程第部分组织病理学诊断法

GBT28630.42012WSD4

3原理国家标准ㅤ可打印ㅤ可复制ㅤ无水印ㅤ高清原版ㅤ去除空白页

3.1白斑综合征的病原和病理学特征

见/—的。

GBT28630.420122.1

3.2技术原理

原位杂交检测方法是以非放射性标记物———地高辛()标记的白斑综合征病毒()核酸探

DIGWSSV

,

针与存在于切片中的进行核酸分子杂交并通过抗原抗体反应和酶底物的化学显色反应

WSSVDNA--

。,

在组织切片上显示出WSSV的存在位点原位杂交可完整保持组织与细胞形态能在复杂组织中对单

,。

一细胞进行病毒检测准确反映组织细胞中病毒的分布

4试剂和材料

,。

4.1除非另有说明在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水

核酸探针按/—中的规定。

4.2GBT28630.120126.2

(,/,):。

碱性磷酸酶偶联的抗体抗生化试剂

4.3DIGAP-DIG0.75UL4℃

μ

4.4二甲苯。

4.5无水乙醇。

4.695%乙醇。

:。

4.7中性树胶生物染色用

():。

4.8石蜡熔点52℃~54℃切片级

(’):。

戴维森氏固定液见附录的规定

4.9AFADavidsonsAFAA

1

/—

GBT28630.32012

:。

乙醇见附录的规定

4.1080%A

:。

乙醇见附录的规定

4.1170%A

:。

乙醇见附录的规定

4.1250%A

/:。

多聚赖氨酸见附录的规定

4.13500μgmLA

:。

4.142×SSC见附录的规定

A

:。

4.151×SSC见附录的规定

A

:。

4.160.5×SSC见附录的规定

A

:。

4.17TNE见附录的规定

A

/蛋白酶:。

mLK见附录的规定

4.18100μgA

:。

甲醛见附录的规定

4.190.4%A

:。

杂交缓冲液见附录的规定

4.20A

:。

缓冲液见附录的规定

4.21ⅠA

:。

缓冲液见附录的规定

4.22ⅡA

:。

缓冲液见附录的规定

4.23ⅢA

:。

缓冲液见附录的规定

4.24ⅣA

:。

显影液见附录的规定

4.25A

():。

俾斯麦棕见附录的规定

4.260.5%YBismarkbrownYA

()。

4.27阳性对照为受WSSV感染且组织病理学上有明显WSSV病灶的对虾组织切片未脱蜡

()。

4.28阴性对照为未受WSSV感染且经原位杂交证明为阴性的对虾组织切片未脱蜡

5器材和设备国家标准ㅤ可打印ㅤ可复制ㅤ无水印ㅤ高清原版ㅤ去除空白页

:。

5.1石蜡切片机满足4m~7m厚度的石蜡连续切片要求

μμ

:,。

5.2水浴锅室温至100℃上下波动1℃

:()()。

5.3显微镜带高倍镜40×和油镜100×

:、、、。

微量移液器量程各支

5.40.5L~10L5L~40L40L~200L200L~1000L1

μμμμμμμμ

:,。

5.5普通冰箱具冷藏箱并带-18℃以下冷冻箱体

5.6程控组织脱水机或使用手工脱水步骤。

5.7石蜡包埋机或使用手工包埋步骤。

5.8程控切片染色机或使用手工染色步骤。

:,。

5.9切片保湿孵育箱室温至50℃上下波动1℃或使用自制的简易湿盒放置于恒温箱中

:,