DB11/T 507-2007 玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法

ICS65.020.20

B21

备案号：21532-2007DB

北京市地方标准

DB11/T507—2007

玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法

SSR-basedMethodtoAssayPurityandGenuinenessinZeamaysL.

2007-11-22发布2008-02-01实施

北京市质量技术监督局发布

DB11/T507—2007

前言

本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。

本标准由北京市农业局提出。

本标准由北京市农业标准化技术委员会种植业分会归口。

本标准起草单位：北京市种子管理站、北京市农林科学院玉米研究中心、全国农业技术推广服务中

心。

本标准主要起草人：贾希海、郭景伦、辛景树、律宝春、田雷、吴明生、赵久然、王凤格、云晓敏、

郭慧杰。

I

DB11/T507—2007

玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法

1范围

本标准依据SSR分子标记原理，规定了进行玉米单交种和亲本自交系的品种纯度及真实性检测方

法的仪器设备及试剂、引物筛选、试验步骤、纯度检测和真实性鉴定。

本标准适用于玉米单交种及亲本自交系的纯度及真实性检测。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

2.1

品种纯度varietalpurity

品种在DNA分子标记带型方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的

百分率表示。

2.2

品种真实性varietalgenuineness

供检品种与标准品种的符合程度。

2.3

SSR分子标记simplesequencerepeatmarker

由寡核苷酸为单位的简单串联重复序列。

2.4

引物primer

结合在模板DNA上的互补短链，提供3＇-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的

互补链。

3原理

在玉米基因组中普遍存在着由寡核苷酸为基本单位的简单串联重复序列，品种间因其重复次数不同

而存在多态性，据此可以利用适宜引物进行PCR扩增，从而检测出特定SSR位点的多态性，以鉴别品种

的纯度及真实性。

4仪器设备及试剂

4.1仪器设备

PCR扩增仪；DNA序列分析电泳槽；高压电泳仪（3000V,400mA,400W）；电子天平（感量0.01g,

0.001g）；冰箱；微量加样器（0.5µL～10µL,20µL～200µL,100µL～1000µL）；磁力搅拌器；胶片观

察灯；水平摇床；高压灭菌锅；酸度计等。

烧杯；镊子；刻刀；量筒；容量瓶（500mL，1000mL）；离心管（0.5mL，1.5mL）；吸头(10µL，200µL，

1000µL)；注射器（100mL）；96孔深孔板；96孔PCR板；封板膜；一次性手套；离心管架；染色盒（55cm

×38cm×8cm）；水平仪；夹子等。

4.2试剂

乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；氢氧化钠(NaOH)；

2+

10倍PCR缓冲液（不含Mg），保存条件为-20℃；氯化镁（MgCl2）；四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs），保

存条件为-20℃；TaqDNA聚合酶（5U/µL），保存条件为-20℃；SSR引物，保存条件为-20℃；矿物油；

1

DB11/T507—2007

去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；硼酸；尿素；亲和硅烷（Binding

Silane）；剥离硅烷（RepelSilane）；无水乙醇；四甲基乙二胺；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛

溶液等。

DNA提试剂、PCR反应试剂、电泳试剂和银染试剂的成分及配制按附录A执行。

5引物筛选

适宜引物筛选应遵守扩增后的杂交种SSR电泳谱带含有双亲谱带，而且带型清晰、重复性好的原

则。

可以利用已经公开发表的引物，也可以自行筛选引物。自行筛选时，取测试杂交种种子10粒及父

母本种子各5粒，利用一系列引物进行分析，从中确定适宜的引物。

常见适用于玉米品种的纯度及真实性分析的SSR引物名称及序列参见附录B。

6方法步骤

6.1DNA提取

剥取种胚，分别放入96孔深孔板中。每孔加入150µLDNA提取液，盖封板膜，煮沸5min后，在

每孔中加入150µLTE缓冲液，形成样品DNA溶液。

样品DNA溶液可以直接进行PCR扩增或在冰箱中冷冻长期保存。

6.2扩增

取96孔PCR反应板一块，每孔中依次加入13.5μL超纯水、2μL10倍PCR缓冲液、2.5μLMgCl2

（25mmol/L）、1.2μLdNTP(2.5mmol/L)、0.25μLSSR引物（20μmol/L）、0.25μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)，

混匀。

每孔再加入2μL样品DNA溶液和1滴矿物油，盖封板膜后放入PCR仪，扩增程序为：94℃预变性

5min；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸5min；4℃保存。

6.3检测

6.3.1胶板制作

将玻璃板洗净，用无水乙醇擦洗两遍，干燥。在长玻璃板上涂0.5%亲和硅烷（BindingSilane）

0.5mL，带凹槽的玻璃板上涂2.0%剥离硅烷（RepelSilane）0.5mL。操作过程中防止两块玻璃板互相

污染。待玻璃板彻底干燥后，将长玻璃板水平放置，在玻璃板上面垂直方向两边放置边条，并与玻璃边

缘对齐，然后，将带凹槽的玻璃板放在长玻璃板的上面，四周对齐，并在有边条的两边用夹子固定，水

平仪调平。

吸取4.5%PA胶80mL，加入四甲基乙二胺80μL和25%过硫酸铵80μL，迅速摇匀。在凹槽一端，沿

灌胶口一边轻轻敲打，一边将胶灌进，灌胶过程中防止出现气泡。待胶流动到另一端，在凹槽一端，将

梳子齿向外，轻轻的插入梳子，使其聚合1h以上。

6.3.2预电泳

在正极槽（下槽）和负极槽（上槽）中分别加入1倍TBE缓冲液600ml，拔出梳子，90W恒功率预

电泳15min～20min。

6.3.3点样

20μlPCR扩增样品加入4μl6倍加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上变性：95℃变性5min，4℃冷

却10min。用吸球吹吸加样槽,清除气泡和残胶，插入样品梳子，每一个加样孔点入5μl样品。

6.3.4电泳

80W恒功率电泳30min。

6.3.5染色

电泳结束后，分开两块玻璃板。将带凝胶的玻璃板浸入固定液中轻轻晃动3min，再放入去离子水

中漂洗10s，然后将胶板放入染色液中染色5min。

2

DB11/T507—2007

将染色后的胶板放入去离子水中漂洗10s，然后在显影液中轻轻晃动直至带纹清晰。

将显影后的胶板放入固定液中定影5min，再用去离子水漂洗1min。

7纯度检测

7.1取样

从送检样品中随机取不少于100粒种子。

7.2SSR分析

按照本标准第6章规定的方法