DB44/T 2340.4-2021 诸氏鲻虾虎鱼 毒理学评价 第4部分：生殖毒性

ICS13.020.40

CCSZ10

44

广东省地方标准

DB44/T2340.4—2021

诸氏鲻虾虎鱼毒理学评价

第4部分：生殖毒性

Mugilogobiuschulae—Toxicologyevaluation—Part4:Reproductiontoxicity

2021-10-18发布2022-01-18实施

广东省市场监督管理局发布

DB44/T2340.4—2021

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4原理...............................................................................2

5方法...............................................................................2

6器材...............................................................................3

7评价步骤...........................................................................3

8质量控制...........................................................................5

9结果与报告.........................................................................5

10诸氏鲻虾虎鱼安乐死................................................................6

11实验室废弃物的处理................................................................6

附录A（资料性）诸氏鲻虾虎鱼雌雄鉴别方法.............................................7

附录B（资料性）诸氏鲻虾虎鱼生殖毒性评价原始记录表...................................8

附录C（规范性）VTGmRNA和ARmRNA相对表达量测定方法...............................16

I

DB44/T2340.4—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

DB44/T2340《诸氏鲻虾虎鱼毒理学评价》分为四个部分：

——第1部分：急性毒性；

——第2部分：摄食抑制；

——第3部分：生长抑制；

——第4部分：生殖毒性。

本文件是DB44/T2340的第4部分。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由广东省科学技术厅提出并组织实施。

本文件由广东省实验动物标准化技术委员会（GD/TC93）归口。

本文件起草单位：广东省实验动物监测所。

本文件主要起草人：李建军、黄韧、朱才毅、余露军、赖素群、林忠婷、陈小曲、曾进、蔡磊。

II

DB44/T2340.4—2021

诸氏鲻虾虎鱼毒理学评价第4部分：生殖毒性

1范围

本文件规定了诸氏鲻虾虎鱼毒理学评价中生殖毒性的原理、方法、器材、评价步骤、质量控制、结

果与报告、安乐死和实验室废弃物处理等要求。

本文件适用于直接或间接排入海洋、入海河口的污染物及受纳水体的生殖毒性评价。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T35517-2017化学品鱼类生殖毒性短期试验方法

SN/T3592实验室化学药品和样品废弃物处理的标准指南

DB44/T2340.1-2021诸氏鲻虾虎鱼毒理学评价第1部分：急性毒性

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

生殖毒性reproductivetoxicity

指外源物质对雄性和雌性生殖功能或能力以及对后代产生的不良效应。

卵黄蛋白原vitellogenin,VTG

一种磷脂糖蛋白，卵黄蛋白的前体，通常存在于卵生动物性成熟雌性个体中。

[来源：GB/T35517-2017，2.1.3，有修改]

雄激素受体androgenreceptor,AR

一种配体依赖性的反转录调节蛋白，介导脊椎动物雄激素的多向效应，对性别分化、性成熟和精子

发生起重要作用。

最大耐受浓度maximumtoleratedconcentration,MTC

受试物引起小于10%死亡率的最高试验浓度。

[来源：GB/T35517-2017，2.1.4]

无可见影响浓度noobservedeffectconcentration,NOEC

实验生物暴露在一组不同浓度的试验溶液一定时间后，通过观察实验生物的不良影响，并比较试验

组与对照组统计分析结果，判定出对实验生物无显著影响（p＞0.05）的最大浓度。

[来源：GB/T18420.2－2009，3.2]

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DB44/T2340.4—2021

最低可观察效应浓度lowestobservedeffectconcentration,LOEC

与对照相比，对受试生物产生显著(p<0.05)效应的最低受试物浓度。

[来源：GB/T21828-2008，2.4]

性腺指数gonadsomaticindex，GSI

性腺重量相对去内脏体重的比例，是性成熟度的一个指标。

参见：GSI=（GW/SW）x100%

式中：

GW——性腺重，单位为克（g）；

SW——去内脏体重（净重），单位为克（g）。

相对生殖力relativefecundity

指一尾雌鱼在一定产卵周期内单位体重或单位体长产出的卵子数量。

孵化率hatchingrate

从卵内破膜而出的仔鱼数量与总卵数的百分比。

不投饵存活系数survivalactivityindex，SAI

衡量仔鱼活力的重要指标。

K

参见：SAI=∑i=1(N−hi)×i/N

式中：

N——起始的仔鱼数量；

K——仔鱼全部死亡所需的天数；

Hi——第i天时仔鱼的累计死亡数。

4原理

VTG是包括性成熟鱼类在内的卵生雌性动物肝脏产生的一种特有蛋白前体，由血液循环进入卵巢，

但在外源类雌激素物质的刺激下，雄鱼肝脏也能产生该蛋白前体；雄激素通过AR激活下游信号通路来行

使其功能，外源类雄激素物质的暴露可诱导ARmRNA的表达。鱼类在污染物中暴露后，通过测定肝脏组

织VTGmRNA和ARmRNA表达水平，可表征水污染物对鱼类的早期生殖毒性效应。此外，环境内分泌干扰

物可通过干扰鱼类性激素水平进而导致鱼类性腺指数、生殖力、孵化率、不投饵存活系数等生殖器官发

育和生殖能力指标异常，这些指标可用于评估受试物的生殖毒性。

5方法

根据试液更换频次可分为静态毒性试验、半静态毒性试验和流水毒性试验。试验期间受试物实测

浓度与配制浓度偏差超过20%或受试物稳定性不明确时，宜采用半静态毒性试验或流水毒性试验。

根据暴露时间可分为Ⅰ期生殖毒性试验和Ⅱ期生殖毒性试验。

5.2.1Ⅰ期生殖毒性试验：试验周期为21d，以VTGmRNA和ARmRNA的表达量为主要检测指标。

2

DB44/T2340.4—2021

5.2.2Ⅱ期生殖毒性试验：试验周期为90d，其中包含持续暴露染毒期30d，转移至清水饲养期60

d，以性腺指数、生殖力、孵化率、仔鱼不投饵存活系数作为主要检测指标。

6器材

主要仪器设备

6.1.1饲养诸氏鲻虾虎鱼以及饵料生物的养殖箱、水处理设备等。

6.1.2测定环境因子的溶氧仪、盐度计、pH计、温度计等。

6.1.3用化学惰性材料制成的试验容器。Ⅰ期生殖毒性试验试验容器体积为2.0L～3.0L；Ⅱ期生试

验容器体积为5.0L～10.0L。

6.1.4电子天平、高速搅拌器、高速台式冷冻离心机、荧光定量PCR仪、生物显微镜、解剖镜、血球

计数板、超净工作台、量筒、胶头滴管、移液管、手抄网等。

诸氏鲻虾虎鱼

6.2.1性别、规格选择

根据试验要求选择雌雄鱼。诸氏鲻虾虎鱼雌雄鉴别方法见附录A。

Ⅰ期生殖毒性试验应选择在水温25.0℃±2.0℃、其它条件适宜的环境下培育的（16±2）周龄雄

鱼，其个体体长宜在平均体长的±20%内。

Ⅱ期生殖毒性试验应选择在水温25.0℃±2.0℃、其它条件适宜的环境下培育的（22±2）周龄实

验鱼，其个体体长宜在平均体长的±20%内。

6.2.2质量

按DB44/T2340.1-2021中6.2.1的规定执行。

受试物

按DB44/T2340.1-2021中6.3的规定执行。

7评价步骤

样品准备

7.1.1稀释水

按DB44/T2340.1-2021中7.1.1的规定执行。

7.1.2贮备液配制

按DB44/T2340.1-2021中7.1.2的规定执行。

预试验

可采用较大的等比系数设置5个等比浓度组和1个阴性对照组。若使用助溶剂应增设助溶剂对照组，

助溶剂的浓度应与试验组中助溶剂的最高浓度一致，试验溶液中助溶剂的最高浓度不得超过0.1‰。可

3

DB44/T2340.4—2021

不设平行组。应记录试验溶液配制过程，试验溶液配制原始记录表见附录B中表B.1。观察诸氏鲻虾虎鱼

96h的死亡情况，确定诸氏鲻虾虎鱼的最大耐受浓度（MTC）范围。

正式试验

7.3.1试验溶液配制

Ⅰ期生殖毒性试验：根据预试验结果，以0.1MTC为最高试验浓度设定至少3个等比浓度组，等比系

数3～10之间，并设阴性对照组、0.1μg/L17β-雌二醇阳性对照组和0.1μg/Lα-甲基睾酮阳性对

照组。每个容器试液体积1.0L。各试验组设3个平行。

Ⅱ期生殖毒性试验：参考Ⅰ期生殖毒性试验结果，设定至少3个等比浓度组，等比系数3～10之间，

设阴性对照组、0.1μg/L17β-雌二醇阳性对照组和0.1μg/Lα-甲基睾酮阳性对照组。每个容器试液

体积3.0L～6.0L。各试验组设2个平行。

若使用助溶剂应增设助溶剂对照组，助溶剂浓度应与试验组中助溶剂最高浓度一致，试验溶液中助

溶剂的最高浓度不得超过0.1‰。

应记录试验溶液配制过程，试验溶液配制原始记录表见附录B中表B.1。

7.3.2诸氏鲻虾虎鱼移入

试验开始前诸氏鲻虾虎鱼停食5h～24h，用手抄网在驯养箱中随机捞取，移入试验容器。

Ⅰ期生殖毒性试验每个容器放雄鱼5尾。Ⅱ期生殖毒性试验每个容器放雌雄鱼各10尾。

在30min内完成实验鱼分放。

7.3.3试验环境条件

按DB44/T2340.1-2021中7.4.3的规定执行。

7.3.4诸氏鲻虾虎鱼投喂

每天每尾鱼投喂卤虫约30个，每个试验容器每次投喂体积不超过0.2mL。

7.3.5试验溶液更换

静态毒性试验不更换试验溶液。

半静态毒性试验每48h至少更换一次试液，每次更换量不少于原试液体积的3/4。宜采用虹吸方式

吸出原液，缓慢加入新液，操作过程中应避免触碰诸氏鲻虾虎鱼。

流水毒性试验每24h至少更换一次贮备液。一个试验容器24h的流量至少为该容器内试验溶液体

积的5倍。试验期间流速变幅不大于10%。

观察和记录

7.4.1水质因子测定和行为、体表特征观察

试验溶液加入前和试验结束时分别测量溶解氧、pH值、盐度等水质因子，每天测量水温、观察诸氏

鲻虾虎鱼死亡、游泳、呼吸、摄食、体色、身体弯曲、鳞片脱落等异常情况，及时移出死亡个体。观测

结果记录于原始记录表中，见附录B中的表B.2。

7.4.2VTGmRNA和ARmRNA相对表达量

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DB44/T2340.4—2021

Ⅰ期生殖毒性试验结束时，采集同一试验容器内所有存活的诸氏鲻虾虎鱼肝脏组织混合为一个样

品，液氮中保存。3个平行组为3个生物学重复样品。

肝脏组织取样按GB/T35517的规定执行。

按附录C的方法测定各样品VTGmRNA和ARmRNA相对表达量，测定结果分别记录于附录B中的表B.3

和表B.4。

7.4.3性腺指数

Ⅱ期生殖毒性试验结束时，100mg/LMS-222麻醉实验鱼，逐一称量性腺（精巢或卵巢）重量和实

验鱼净重（去内脏体重），结果记录于原始纪录表中，见附录B中的表B.5。

7.4.4生殖力

Ⅱ期生殖毒性试验转移至清水饲养期间每天观察诸氏鲻虾虎鱼产卵情况。雌鱼产卵后，计数产卵量，

测量雌鱼体长，结果记录于原始纪录表中，见表B.6。

7.4.5孵化率

Ⅱ期生殖毒性试验转移至清水饲养期间，每批鱼卵产出后，置于稀释水中，在水温25℃±2℃、

光照54lx～524lx、溶氧大于5mg/L的条件下孵化，观察孵出鱼苗数，测定试验期间测定水质，观

测结果记录于原始纪录表中，见表B.7。

7.4.6不投饵存活系数

Ⅱ期生殖毒性试验转移至清水饲养期间，每批仔鱼孵出后，随机取100尾初孵仔鱼（出膜2小时内），

在DB44/T2340.1-2021B.2环境条件下不投饵饲养，测定试验开始和结束的水质环境因子，并每天观察

仔鱼的存活数，直至仔鱼全部死亡。试验结果记录于原始纪录表中，见表B.8。计算不投饵存活系数SAI

值及半数致死时间。

8质量控制

有效的试验应符合以下条件：

——试验结束时，对照组（包括阴性对照组、溶剂对照组）诸氏鲻虾虎鱼死亡率不大于10%；

——在23℃～27℃条件下，与阴性对照组相比，0.1μg/L的17β-雌二醇阳性对照组暴露21

d后，雄性诸氏鲻虾虎鱼肝脏VTGmRNA相对表达量显著提高（p≤0.05）；0.1μg/L的α-

甲基睾酮阳性对照组暴露21d后，雄性诸氏鲻虾虎鱼肝脏ARmRNA相对表达量显著提高（p

≤0.05）；Ⅱ期生殖毒性试验对照组产卵次数低于2次占比不超过50%；

——原始记录应完整，包括样品名称、编号、试验时间、评价依据、驯养记录等。

9结果与报告

结果计算

应对阳性对照组和阴性对照组、试验组和阴性对照组之间的生殖毒性效应进行比较分析，计算NOEC

或LOEC。如使用了溶剂对照，应比较分析阴性对照组和溶剂对照组之间的毒性效应显著性差异。

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DB44/T2340.4—2021

采用Shapiro-Wilk法和Bartlett’s法对试验结果进行正态分布和方差齐次检验。如果试验结果符

合正态分布和方差齐次检验，则采用单因素方差分析（ANOVA）或多重比较分析（Dunnett's法），判定

阴性对照组和不同浓度组之间是否存在显著性差异，确定NOEC或LOEC；如果试验结果不符合正态分布或

方差齐次检验，则采用非参数方法（Jonckheere法）确定NOEC或LOEC。

评价报告

评价报告应包括以下内容：

a)受试样品的名称、来源、保存方法、保存时间等；

b)诸氏鲻虾虎鱼来源、体长、驯养和配对情况；

c)试验条件：

1)试验方式，如半静态毒性试验或流水毒性试验，以及曝气、密度等；

2)贮备液和试验溶液配制方法、浓度；

3)各试验容器诸氏鲻虾虎鱼的数量；

4)试验溶液配制后和试验结束时的环境指标，如水温、溶氧、盐度、pH等。

d)结果：

1)对照组和各浓度组诸氏鲻虾虎鱼的死亡率；

2)试验期间，受试物对诸氏鲻虾虎鱼的毒性效应（行为和体表特征等）；

3)阳性对照和阴性对照21d的VTGmRNA和ARmRNA相对表达量显著性分析结果；

4)试验组与阴性对照21d的VTGmRNA和ARmRNA相对表达量显著性分析结果，NOEC或

LOEC及其计算方法；

5)阳性对照和阴性对照90d的性腺指数、生殖力、孵化率、不投饵存活系数显著性分析结

果；

6)试验期间，可能会影响试验结果的因素。

10诸氏鲻虾虎鱼安乐死

按照DB44/T2340.1-2021第10章的规定执行。

11实验室废弃物的处理

实验室样品及废弃物按SN/T3592的规定执行。

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DB44/T2340.4—2021

A

A

附录A

（资料性）

诸氏鲻虾虎鱼雌雄鉴别方法

A.1形态特征

诸氏鲻虾虎鱼雄鱼和雌鱼形态特征比较见表A.1。

表A.1诸氏鲻虾虎鱼雄鱼和雌鱼形态特征比较

雄鱼雌鱼

头略平扁、中大，腹部扁平。头稍钝圆，腹部膨大。

第一背鳍第2根～4根鳍棘末端延长呈丝状，最长鳍棘可延第一背鳍第2根～4根鳍棘末端延长呈丝状，最长鳍棘仅延伸

伸至第二背鳍第五鳍条基部。至第二背鳍第一鳍条基部。

上颌骨延伸至瞳孔中心的垂直线。上颌骨延伸至眼眶前缘的垂直线。

成熟个体胸鳍基部有一个棕黑色斑点，斑点外边界呈黄色成熟个体胸鳍基部有一个棕黑色斑点，斑点外边界呈灰白色。

尾鳍膜呈浅灰黑色。