DB53/T 962-2020 烟草疫霉土壤带菌定量技术规程

ICS65.160

B35

云南省地方标准

DB53/T962—2020

烟草疫霉土壤带菌定量技术规程

2020-04-26发布2020-07-26实施

云南省市场监督管理局发布

DB53/T962—2020

前言

本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。

本标准由云南省烟草专卖局（公司）提出。

本标准由云南省烟草标准化技术委员会（YNTC12）归口。

本标准起草单位：云南省烟草农业科学研究院、云南农业大学、云南省烟草质量监督检测站、云南

省烟草公司大理州公司、云南省烟草公司昆明市公司。

本标准主要起草人：方敦煌、肖炳光、夏振远、曾建敏、秦西云、童治军、姬广海、孙浩巍、范志

勇、徐兴阳。

I

DB53/T962—2020

引言

本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到本标准第4.5条与ZL201510635459.3

《一种土壤烟草黑胫病发病潜力的预测方法》相关的专利的使用。

本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。

该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他同意在公平、合理、无歧视基础上，免费许可任何组

织或者个人在实施该地方标准时实施专利。相关信息可通过以下联系方式获得：

专利发明人：方敦煌、李永平、肖炳光、曾建敏、童治军

专利权人：云南省烟草农业科学研究院

地址：云南省昆明市五华区圆通街33号

请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利

的责任。

II

DB53/T962—2020

烟草疫霉土壤带菌定量技术规程

1范围

本标准规定了烟草疫霉菌定量检测以及土壤带菌量等级划分等要求。

本标准适用于烟草疫霉菌的定量检测，烟草疫霉菌土壤带菌量等级划分。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T23222烟草病虫害分级及调查方法

GB/T23224烟草品种抗病性鉴定

GB/T25241.1烟草集约化育苗技术规程第1部分：漂浮育苗

GB/T25241.2烟草集约化育苗技术规程第2部分：托盘育苗

GB/T25241.3烟草集约化育苗技术规程第3部分：砂培育苗

NY/T1121.1土壤检测第1部分：土壤样品的采集、处理和储存

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

烟草疫霉菌

烟草疫霉菌（PhytophtoranicotianaeBreda）是烟草黑胫病的病原菌，在土壤中以休眠体（如厚垣

孢子、菌丝体等）的形态存在，休眠体萌发后形成游动孢子囊，再释放游动孢子侵染烟草。在一个烟草

生长季节中能够连续繁殖多代，不断释放游动孢子，通过流水或雨水飞溅传播形成再侵染。

4烟草疫霉菌定量检测

4.1土样采集与前处理

在土地平整后、理墒前按NY/T1121.1采集土壤样品，过2mm筛制备土壤测试样品。

4.2土壤稀释平板菌落计数法定量检测

4.2.1选择性培养基的制备

选择性培养基按照附录A配制。

4.2.2土壤稀释平板菌落计数法定量

4.2.2.1土壤悬浮液稀释

1

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称取过筛后的土壤测试样品l0g，放入250mL带塞三角瓶中，再加入已灭菌的40mL0.25%水琼脂，

置于漩涡振荡器上充分混匀，5倍系列稀释，每份土样3次重复。

4.2.2.2涂布平板

吸取5-2、5-3、5-4土壤稀释液各200μL，涂布于选择性培养基平板上，每份样品每个稀释梯度涂布5

个平板，置于（24～26）℃恒温培养箱中培养（48～72）h后，疫霉菌在选择性培养基上形成丛状菌落。

4.2.2.3菌落计数

挑选菌落形态较易区分、菌落数（称为菌落形成单位Colony-FormingUnits，简称cfu）在（5～

15）个的平板，标记疑似菌落，将同一样品相同稀释度的5个平板中的菌落数相加计数。

每1g土样形成的疑似菌落数计算公式为每1g土壤（干重）中烟草疫霉菌数量＝（同一稀释度3次

重复的菌落平均数×稀释倍数）/（1-土壤含水量）

4.2.2.4校正定量

挑取同一样品（30～50）个疑似烟草疫霉菌菌落5mm×5mm的菌丝块，按照附录B鉴定疑似菌落，

判别、统计阳性结果的百分比，以此校正定量各土样中的烟草疫霉菌含量。

4.3荧光定量PCR检测

4.3.1烟草疫霉菌DNA提取

按附录B提取烟草疫霉菌DNA，保存于-20℃冰箱中备用。

4.3.2荧光定量PCR引物

用于荧光定量PCR的特异性引物核苷酸序列为：

——ParA1F:5’-CATTGAGTAGCCAGAGTCCGTC-3’；

——ParA1R:5’-CCACCACGCAGCAAACTGCGGC-3c’。

4.3.3实时荧光定量PCR检测

4.3.3.1反应程