DB33/T 752-2022 植物种苗组培快繁技术规程

ICS65.020.20

CCSB05

33

浙江省地方标准

DB33/T752—2022

代替DB33/T752—2009

植物种苗组培快繁技术规程

Technicalregulationforplantmicropropagation

2022-05-17发布2022-06-17实施

浙江省市场监督管理局发布

DB33/T752—2022

目次

前言................................................................................II

1范围..............................................................................1

2规范性引用文件....................................................................1

3术语和定义........................................................................1

4植物组培工厂建设..................................................................1

5设备、器材及试剂..................................................................2

6组培车间管理......................................................................2

7组培苗生产技术流程................................................................3

8无菌接种操作及注意................................................................6

9组培苗移栽和穴盘苗生产............................................................7

10出苗、包装、运输.................................................................8

附录A（资料性）植物组培工厂所需仪器和设备..........................................9

附录B（资料性）植物组培工厂所需器皿及器材.........................................13

附录C（资料性）植物组培常用试剂...................................................16

附录D（资料性）植物组织培养常用基本培养基成分.....................................20

附录E（资料性）MS培养基母液配制表................................................22

附录F（资料性）植物组培常用植物生长调节剂母液配制.................................23

附录G（资料性）植物种苗组培快繁流程示意图.........................................24

附录H（资料性）温室育苗常见病虫害及防治...........................................25

I

DB33/T752—2022

前言

本标准按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本标准代替DB33/T752—2009《植物种苗组培快繁技术规程》，与DB33/T752—2009相比，除结构

调整和编辑性修改外，主要技术变化如下：

a)增加了规范性引用文件(见第2章)；

b)修改了部分术语和定义(见第3章，2009版第2章)；

c)修改了组培工厂建设(见第4章和第5章，2009版第3章)；

d)修改了组培车间管理(见第6张，2009版第5章、7.1、7.2、7.3和第10章)；

e)修改了组培苗生产技术流程(见第7章，2009版第4章、第6章和第8章)；

f)修改了无菌接种操作及注意(见第8章，2009版第9章)；

g)修改了组培苗移栽和穴盘苗生产(见第9章，2009版第11章)；

h)删除了质量标准(见2009版第11章)；

i)删除了附录A和附录C（见2009版附录A、附录C）；

j)修改了部分附录结构及内容(见附录A、B、C、D、E、F和附录G，2009版附录D、E、F、G、H、

I和附录B)；

k)增加了温室育苗常见病虫害及防治(见附录H)。

请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别专利的责任。

本标准由浙江省农业农村厅提出并组织实施。

本标准由浙江省种植业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：浙江省农业科学院。

本标准主要起草人：陈剑平、陈志、汪一婷、吕永平、牟豪杰、李海营、K.BKumar、王燕。

本标准的历次版本发布情况为：

——DB33/T752—2009；

——本次为第一次修订。

II

DB33/T752—2022

植物种苗组培快繁技术规程

1范围

本标准规定了植物种苗组培快繁的术语和定义、植物组培工厂建设、设备、器材及试剂、组培车间

管理、组培苗生产技术流程、无菌接种操作、组培苗移栽和穴盘苗生产及包装、标签、运输等内容。

本标准适用于植物种苗组培快繁。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

标准。

GB/T191包装储运图示标志

GB50009建筑结构荷载规范

NY/T2306花卉种苗组培快繁技术规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

继代

植物材料经过一段时间培养后，培养材料从原培养基中转出，在无菌条件下经过切割后转接到新鲜

培养基中继续增殖培养的过程。

3.2

外植体

从活体植物上获取的用于植物组培生产的组织或器官。

3.3

组培苗

利用植物组织培养方式生产获得的苗。

4植物组培工厂建设

4.1工厂选址

厂址宜选择地势较高、排水良好，远离污染源，通水通电，交通便利的位置。

1

DB33/T752—2022

4.2厂房建设

地基宜高出地面30厘米以上；地面、外部墙体和顶层宜作防潮、防水、防渗、保温和隔热相关处理，

内部墙壁光滑，防水；厂房为2层以上的建筑时，应安装物流电梯；地面和多层结构的楼面均布活荷载、

雪压、风压荷载系数按GB50009中书库建设指标。

4.3功能区规划及要求

4.3.1组培车间

组培车间包括洗涤室、培养瓶晾干室、试剂室(称量室)、培养基配制室、灭菌室、培养基储存室、

更衣室、接种室、培养室、出苗室和储物室功能区等。各功能区域应根据生产工艺流程次序，设计为连

续、有序、通畅和合理的流水线。厂房为多层建筑时，培养室设在二楼及以上楼层，其余功能区设在一

楼；组培室净道、污道分离，人、物流分开。接种操作区按100级净化标准设计；培养基储存室、接种

室、培养室按10万级净化标准设计；试剂室(称量室)、培养基配制室、灭菌室、更衣室和出苗室等按30

万级净化标准设计；储物室、洗涤室、培养瓶晾干室防尘、防潮，通风良好；不同级别洁净区出入口处

安装风淋装置；洁净区域内配置消毒灭菌设备、空气净化和洁净新风补偿系统。

4.3.2管理区

管理区包括办公室、会议室和其它必要工作空间等。

4.3.3温室

温室包括母本保存圃、组培苗驯化区和组培苗培育区等。

5设备、器材及试剂

5.1设备

植物组织培养所需设备包括灭菌设备、培养设备、实验设备、办公设备和消防设施等，具体参见附

录A。

5.2器材

植物组织培养所需器材包括各类器材、器皿以及其它常用消耗品等，具体参见附录B。

5.3试剂

植物组织培养所需的无机盐类、有机物类、植物生长调节剂、消毒剂等，各类试剂的品名、纯度等

级和储存方法参见附录C。

6组培车间管理

6.1污染容器灭菌

污染的容器在未打开的情况下，在0.10MPa～0.11MPa、121℃条件下，灭菌30分钟～40分钟。

6.2培养容器的清洗

2

DB33/T752—2022

清空培养容器内部材料和培养基后放入洗洁精或洗衣粉溶液中浸泡，浸泡时间不应少于1小时，然

后清洗掉容器内、外壁附着物后，再用自来水冲洗内、外壁3遍～5遍。清洗干净后，培养容器后倒扣于

组培用托盘中沥水、晾干备用。清洗干净的培养容器壁不挂水珠，晾干的培养容器内外壁无明显的斑点、

污迹。

6.3人员管理

组培车间人员换鞋、穿工作服后，经风淋除尘进入车间。进出随手轻轻关门。

6.4清洁及消毒

车间内部每周用消毒液(0.1%新洁尔灭溶液等)清洁车间内部地面、门窗等。每两周用紫外灯照射

30分钟或臭氧发生器消毒60分钟。紫外灯按每平方米配置2瓦的比例进行配置，臭氧消毒时，内部空间

保持70%～80%相对湿度，温度保持在25℃～35℃，臭氧浓度为10毫克/立方米～20毫克/立方米。定期

检查培养室内漏雨及墙壁长霉情况，发现有霉菌时应及时去除，并用防菌涂料粉刷墙壁。

6.5污染检查

培养材料污染应有专人检查、清理，并做好记录。发现污染瓶，不应在培养间及走道内开启，立即

转移至洗涤间，按照6.1进行灭菌，然后正常清洗，并对处理情况作记录。污染率若超过3%，应及时反

馈给操作人员及管理人员，协同进行原因分析，采取相应的措施。

6.6设备管理

空调设备出风口每年至少应进行一次清洗和消毒处理；整体净化组培室每半年更换高效过滤装置，

清洁通风管道；定期检查各种设备使用状况，发现异常应及时进行处理。

6.7厂房外部清洁

厂房外部保持清洁、无堆积杂物，定期清理厂房周边杂草。

7组培苗生产技术流程

7.1母液配制

7.1.1母液种类

母液的配制根据培养材料及培养目的选择合适的基本培养基和植物生长调节剂种类及浓度配比，常

见基本培养基成分见附录D。

7.1.2化学试剂选择

母液配制应选择纯度符合要求且在有效期内的试剂，使用前目测应无异物、异色或者吸湿结块。

7.1.3水质要求

母液配制应用蒸馏水或去离子水。

7.1.4配制方法

3

DB33/T752—2022

母液配制时，不同试剂分开称量，单独溶解，再逐步混合后定容。配置好的母液应无色透明(铁盐

黄色透明)，无浑浊、沉淀。MS基本培养基母液配制及保存方法见附录E，其它基本培养基母液配制可参

考该方法；植物生长调节剂的母液配制及保存方法见附录F。

7.1.5过滤灭菌试剂母液配制

将需要过滤灭菌的试剂按照附录F配制成溶液，超净工作台上，用无菌的过滤器(滤膜孔径为0.22

微米)进行过滤灭菌，滤液用1.5毫升～50.0毫升无菌离心管进行分装，可现配现用，也可配好后密封冻

存。冻存前注明试剂名称、浓度及灭菌日期后在-20℃保存，冻存时每管试剂体积不超过最大容量80%；

冻存试剂解冻使用后若有剩余试剂不可再次冷冻保存和使用。

7.1.6标签及保存

母液配好后盛装容器外表面应贴好标签，注明名称、浓度、配制日期，保存方法参照附录E和附录F。

7.2培养基配制

7.2.1配制前准备

使用前应先检查各种母液及试剂是否符合要求，对于不符合要求的母液或试剂应重新配制或购买。

根据培养材料及培养目的选择合适的基本培养基和植物生长调节剂种类并准备好各类容器、蒸馏水(或

纯净水)、琼脂(或其他类型凝固剂)、蔗糖(或白砂糖)等。

7.2.2培养基配制

以配制1升培养基为例。按比例加入各种母液并充分搅拌均匀，再加入蔗糖或白砂糖(一般为30克/

升，具体用量根据培养的目标而定)，加蒸馏水至300毫升～400毫升(所需配制培养基体积的30%～40%)，

搅拌，使糖充分溶解。另取容器，加入蒸馏水400毫升～500毫升(所需配制培养基体积的40%～50%)，

再加入琼脂6克～9克，加热搅拌使琼脂溶化(如更换琼脂生产公司及批次，在培养基配制前须取少量琼

脂测试合适用量)。将配制好的各种母液混合液加入到融化的琼脂中，搅拌均匀，加蒸馏水定容，用1

mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调节培养基pH至要求值(一般为pH5.5～pH6.0)，然后根据不同需要定量

分装，培养基厚度以高于瓶底1.0厘米～1.5厘米为宜,分装时培养基不得沾在培养瓶口周围及外壁。分

装好后即盖上瓶盖，密封瓶盖旋紧后稍微回旋拧松瓶盖；有透气孔瓶盖无需回旋；也可用组培专用封口

膜封口，用棉线或橡皮筋扎紧瓶口。

7.2.3培养基、接种器械灭菌及存放

培养基封口后，0.1MPa～0.11MPa、121℃环境下，灭菌18分钟～20分钟，灭菌完成后待灭菌锅内

温度低于90℃时，将培养基及时取出，拧紧瓶盖；若用组培专用封口膜封口则无需拧紧。灭菌后的培

养基应注明编号及配制日期，储存于培养基储藏室内。为检验灭菌效果，宜将配制好的培养基放置3天～

5天后再用，但存储时间不应超过15天。培养基当天配制当天灭菌。接种器械用纸或布包好后，在1.1

kg∙cm-2～1.2kg∙cm-2、121℃条件下，灭菌30分钟～40分钟。接种器械当天灭菌当天使用。

7.2.4特殊培养基配制

液体培养基加好母液及所需试剂后直接定容，然后调整培养基pH，后续步骤与固体培养基配制同。

对于使用无需加热凝固剂的培养基，配制方法与液体培养基配制同，调整pH后，加入凝固剂，在分装过

程中充分搅拌混匀，后续步骤与固体培养基配制同。添加不耐高温植物生长调节剂的培养基配制时，将

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DB33/T752—2022

植物生长调节剂经过滤灭菌或母液解冻，然后在超净工作台上加到经高温灭菌后温度降至50℃～55℃

的培养基中，充分混匀、分装，封口、冷却并存储。

7.3母本材料引进及保存

从境外或国内跨区域引进植物材料，应有原产地有效检疫证明，并按植物检疫隔离观察要求种植在

隔离区内，检疫合格后，可投入组培生产，也可根据母本材料生长特性在温室内培养或露地栽培保存；

以种子形式引进的新品种，按照所附的保藏和播种育苗技术说明处理，若无说明可低温干燥保存，待气

候条件适宜即可进行播种；珍稀植物种子或种子数量较少时可将种子直接通过组织培养方式进行快繁、

保存。保护品种商业生产需获得品种权授权。

7.4外植体采集

外植体选择在不同植物生长旺盛季节进行采集，以茎、叶、芽等为外植体时，宜在晴天午后或植物

表面露水干后采集。

7.5外植体消毒

外植体清洗干净表面附着物后，切至适合尺寸(一般2厘米～3厘米)，种子剥去硬质种皮。预处理好

的外植体，用洗洁精等中性洗涤剂加少许吐温溶液浸泡并振荡清洗10分钟～20分钟，然后在自来水下流

水冲洗干净表面残留洗涤液。将冲洗干净的外植体在准备好的超净台上移至无菌锥形瓶中，倒入体积比

70%～75%酒精溶液并没过外植体表面0.5厘米～1.0厘米，轻摇锥形瓶以除去植物材料表面气泡，30秒～

60秒后将酒精倒出，然后用有效氯浓度0.25%～2.00%的次氯酸钠溶液浸泡经酒精溶液处理的植物材料，

浸泡时间一般为10分钟～30分钟(次氯酸钠浓度及浸泡时间根据材料类型而异)，期间不断轻摇锥形瓶以

除去外植体表面气泡。消毒结束后，倒出次氯酸钠溶液，植物材料用无菌水清洗材料3遍～5遍，待用。

酒精消毒后，可用质量比0.1%氯化汞溶液代替次氯酸钠溶液进行表面消毒，时间一般为5分钟～15分钟，

然后清洗，待用，氯化汞废液按NY/T2306处理。

7.6初代培养

在超净工作台上，将经消毒的外植体取出放在接种盘内或无菌纸上，稍晾干表面水分，1瓶接种1

个外植体接种在培养瓶内。1套工具1次取3个～5个植物材料，同一批接种完毕后更换接种工具、接种盘

或无菌纸。接种完成后统一贴上标签，注明植物品种、接种日期、接种培养基等信息，放在托盘内，送

入培养室进行培养。培养室的温度一般控制在25℃±5℃，同一培养层内底部光照强度20μmol•m-2•

s-1～50μmol•m-2•s-1，光照时间每天10小时～16小时，每天早上、中午、下午各检查一次培养室照明、

温度情况并做好记录。

7.7继代培养

经诱导形成的不定芽、愈伤组织等材料转接到增殖培养基中进行培养，培养周期一般为3周～8周，

培养代数宜控制在30代以内。

7.8分化培养

愈伤组织通过调整培养基及培养环境环境，分化出不定芽、不定根或体细胞胚。

7.9生根培养

从增殖培养或分化培养的符合生根要求的不定芽或体细胞配，分成单株接种在生根培养基中进行生

根培养。培养周期一般为3周～8周。幼苗基部长出3条～5条1厘米～2厘米长的不定根即可进行炼苗移栽。

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DB33/T752—2022

增殖培养形成的芽个体较小时，可将接种到壮苗培养基中进行培养，促进芽长高、长壮。培养周期一般

为3周～8周。

8无菌接种操作及注意

8.1接种前准备

准备好体积比70%～75%酒精溶液、无菌脱脂棉或纱布、接种器械等。打开超净工作台(或洁净无菌

接种室)电源，开启超净工作台的风机，若使用电热灭菌器，同时打开电热灭菌器电源。用体积比70%～

75%酒精溶液擦拭超净工作台内壁，打开超净工作台、接种室、更衣室及缓冲室的紫外灯30分钟；紫外

灯关闭30分钟后方可进入室内。

8.2接种人员除尘、消毒

接种人员洗净双手，在更衣室更换接种服，戴上帽、口罩，并换穿拖鞋等，经风淋除尘后方可进入

接种室，上超净工作台后用70%～75%的酒精溶液擦拭手部(包括手腕)，然后在超净工作台内吹干双手。

8.3培养基和母瓶的准备

进入接种室前，仔细检查培养基和母瓶，若发现污染立即剔除，按6.1灭菌、清洗。接种材料和培

养基通过传递窗进入接种室，用体积比70%～75%酒精溶液喷雾培养基和母瓶表面，放于超净工作台旁

备用。

8.4接种盘(纸)的取放

从布(纸)包里取出接种盘(纸)，接种盘口朝下放在超净工作台面上，注意手不能接触接种盘的边缘，

盘口与超净工作台桌面接触的接种盘不可用，与超净工作台接触的接种纸也不可用。

8.5接种器械灭菌

在超净工作台上，接种器械250℃±10℃灭菌3分钟以上，取出充分冷却待用，一台超净台一般配

备3套接种器械，交替灭菌、冷却和接种。

8.6接种及封口

无菌接种盘(纸)放置在超净工作台内离台面边缘10厘米～20厘米。打开母瓶瓶盖，瓶口略倾斜向超

净工作台内壁，取出无菌苗放于无菌接种盘内或无菌纸上面；一次取苗不宜太多，以免风干。切苗过程

中，手术刀和镊子应在接种盘(纸)后斜上方操作；切苗过程中产生的废弃物可放置在接种盘内的一侧，

不能散落在工作台面。材料切割好后，打开新培养基瓶盖，瓶盖口朝上或封口膜口朝下放置在无菌接种

盘内，放置瓶盖或封口膜的接种盘一般接种3瓶～5瓶后需要更换；组培苗在瓶内应分布均匀、整齐；接

种深度以组培苗不倒为宜；组培苗基部不应与瓶底接触；接苗时镊子及苗均不应碰到培养瓶瓶口或外壁；

接苗完成后及时盖紧瓶盖或用封口膜封口并扎紧，接种器械用70%～75%酒精溶液清洗后，按8.5灭菌，

循环使用。

8.7记录及培养

将植物品种、培养基、接种人及接种日期等信息标示到培养瓶上。从传递窗传出接种室，送至培养

室进行培养培养，培养室光照强度、培养温度及管理同7.6。

8.8关机

6

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熄灭酒精灯或关闭电热灭菌器电源。清理干净超净工作台面，并用体积比70%～75%酒精溶液擦拭

超净工作台面，台面上物品摆放整齐，关闭超净工作台电源。接种过程中所产生的废弃物应交由专人处

理。

8.9接种人员的注意事项

接种人员应注意个人卫生，勤剪指甲。接种过程中手上无佩戴物，接种人员的头、胳膊肘以上肢体，

不应探入超净工作台内；带好口罩、帽子（长发不外露），不应攀谈。

8.10接种操作的安全管理

8.10.1灭菌器械注意

酒精灯点燃时应远离盛酒精溶液的容器；器械灼烧后不应立即插入盛有酒精溶液的容器中；酒精灯

点燃后，不可用酒精溶液喷洒超净工作台。接种人员手上酒精溶液未干时，不应点燃酒精灯或靠近点燃

的酒精灯。

8.10.2险情应急处理

一旦发生火情，应立刻切断灭菌器械、工作台及接种室电源，火源小时，用水浸透的布覆盖灭火；

若火势较大，用灭火器扑灭；更大火情应立即疏散人员并报警。

9组培苗移栽和穴盘苗生产

9.1炼苗

将符合移栽要求的组培瓶苗放置在有散射光(60μmol∙m-2∙s-1～100μmol∙m-2∙s-1)的温室中，温度宜控

制在15℃～35℃，培养3天以上。

9.2移栽

移栽基质用广谱性杀菌剂溶液处理。轻轻取出组培苗，洗净表面培养基，置于阴凉处。将表面稍干

的组培苗栽于育苗容器中，栽入后稍压紧，以基质不压苗芯、幼苗不倒为宜，标记好品种、移栽日期。

9.3管理

移栽2周～4周内用薄膜小拱棚保湿，相对湿度控制在80%～95%，当第一片新叶完全张开后，逐渐

降低薄膜小拱棚内湿度，4周～6周后完全打开小拱棚，大棚相对湿度保持在60%～80%。移栽4周内，薄

膜拱棚内的光照强度控制在60μmol∙m-2∙s-1～100μmol∙m-2∙s-1，之后逐渐增大光照强度。室外光照强度大

于200μmol∙m-2∙s-1时，应进行遮光，温度高于35℃时应降温。

9.4肥水管理

根据不同植物品种生长特性进行水肥管理。

9.5病虫害防治

移栽4周后，每周喷施75%百菌清可湿性粉剂或80%多菌灵可湿性粉剂1000倍～1250倍液1次；移栽

8周后，追施2.8%阿维菌素乳剂2000倍液防治线虫。温室内宜均匀悬挂25厘米×40厘米的黄色诱虫板，

悬挂高度应高于穴盘苗15厘米，密度以每20平方米悬挂1张为宜。温室育苗常见病虫害及防治方法参见

附录H。

7

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10包装、标签、运输

10.1包装

达到出圃标准的种苗包装应符合客户要求，如无特殊要求，可用泡沫箱或纸板箱进行包装，做好保

温、防水、防压和防震。

10.2标签

每箱应贴上标签，注明品种、等级、规格、数量、产地、出苗日期、目的地、联系人、注意事项等。

包装运输图示标志应符合GB/T191要求。

10.3运输

种苗运输过程中应避免倒置、挤压、日晒、雨淋，温度保持10℃～25℃，相对湿度保持60%～90%

为宜，出圃后3天内定植。

8

DB33/T752—2022

AA

附录A

（资料性）

植物组培工厂所需仪器和设备

表A.1给出了植物组培工厂所需仪器和设备。

表A.1植物组培工厂所需仪器和设备

仪器设备名称规格型号用途说明

灭菌设备、器械

立式高压灭菌锅—培养基灭菌

卧式高压蒸汽灭菌锅—培养基灭菌

电热干燥箱—玻璃器皿灭菌、干燥

紫外灯—房间消毒

臭氧机—房间消毒

灭菌不能高温灭菌的试

过滤灭菌器过滤器滤膜孔径0.22μm

剂

接种设备及器械

超净工作台水平或垂直送风；100级洁净度接种，过滤灭菌等

电热灭菌器灭菌温度可调接种器械灭菌

枪状镊25cm～30cm，不锈钢材质接种用

石英玻璃珠Φ2.0mm～2.5mm电热灭菌器导热、保温

手术刀柄不锈钢材质接种用

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DB33/T752—2022

表A.1植物组培工厂所需仪器和设备（续）

仪器设备名称规格型号用途说明

手术刀片—植物材料切割

手术剪—材料剪切

搁置、冷却热的、已灭

接种器械搁置架不锈钢材质

菌的接种器械

接种盘不锈钢材质盛装，切割植物材料

培养设备和容器

光照培养箱光照强度、光照时间可调，温度5℃～50℃可调；温度变幅±1℃组培试验用

组培用托盘可高温灭菌放置培养瓶

空调—培养室温度控制

培养架喷塑角钢，每层2支灯管放置培养瓶，植物培养

晾瓶架喷塑角钢洗净培养瓶晾干

培养瓶玻璃、高透塑料容器组培用瓶

精确称量微量元素及

电子分析天平最小分度值0.1mg

生长调节物质等

称量大量元素及蔗糖、

电子精密天平最小分度值0.1g

琼脂等用量大的物品

蠕动泵及分配器—培养基分装

小型去离子水设备—母液配置用水

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DB33/T752—2022

表A.1植物组培工厂所需仪器和设备（续）

仪器设备名称规格型号用途说明

磁力搅拌器—配置母液、培养基

标准pH计—培养基pH测试

照度计—测量培养室光照强度

冰箱—药品、母液存储

微波炉—溶液加热

体视显微镜—植物茎尖剥离

可拍照体式显微镜；配套照相设备分辨率