GB/T 35514-2017 化学品 线蚓繁殖试验

ICS13.300；13.020

A80£3©

中华人民共和国国家标准

GB/T35514—2017

化学品线蚓繁殖试验

Chemicals—Enchytraeidreproductiontest

2017-12-29发布2018-07-01实施

发布

GB/T314—2017

目次

冃URI

1范围1

2规范性引用文件1

3术语和定义1

4受试物所需信息2

5原理2

6参比物2

7仪器设备3

8试验系统3

9试验程序5

10试验有效7

11数据处理8

12结果报告9

附录A（资料性附录）土壤pH值的测定10

附录E（资料性附录）最大持水量的测定11

附录C（资料性附录）其他种类线蚓的试验操作12

附录D（资料性附录）线蚓的驯养条件14

附录E（资料性附录）受试生物的计数方法15

附录F（资料性附录）数据统计评估的概括（NOEC的确定）16

参考文献17

GB/T314—2017

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刖弓

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准与经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No.220(2004年)《线蚓繁殖试验》(英文

版)技术性内容一致。

本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。

本标准起草单位:广东省微生物研究所、环境保护部固体废物与化学品管理技术中心、沈阳化工研

究院、中国检验检疫科学研究院、广东中科英海科技有限公司。

本标准主要起草人：梅承芳、柳燕贞、曾国驱、刘纯新、林健辉、陈会明、郭琳琳、张静、张宝兰、

李雪君。

T

GB/T314—2017

化学品线蚓繁殖试验

1范围

本标准规定了化学品线蚓繁殖试验的术语和定义、受试物所需信息、原理、参比物、仪器设备、试验

系统、试验程序、试验有效、数据处理与结果报告。

本标准适用于评价受试物对土壤中线蚓繁殖量的影响。

本标准不适用于挥发性物质，如亨利常数或气/水分配系数大于1、或蒸气压超过0.0133Pa

(25°C)的物质。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T21809化学品蚯蚓急性毒性试验

GB/T21851化学品批平衡法检测吸附/解吸附试验

GB/T27860化学品高效液相色谱法估算土壤和污泥的吸附系数

ISO11268-2：2012土壤质量污染物对蚯蚓的影响对赤子爱胜蚓/安德爱胜蚓繁殖影响的测

定(Soilquality—Effectso£pollutantsonearthworms—Determinationofeffectsonreproductionof

Eiseniafetida/Eiseniaandrei)

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

产生x%效应的浓度effectconcentrationforx%effect

ECr

与对照组相比，在给定的暴露时间内对受试生物产生工％效应的受试物浓度。以每单位试验土壤

干重所含的受试物量表示。

3.2

非致死浓度nolethalconcentration

LCo

在给定的时间内不会造成任何受试生物死亡的最高受试物浓度。以每单位试验土壤干重所含的受

试物量表示。

3.3

半数致死浓度medianlethalconcentration

LC5o

在给定的时间内造成50%受试生物死亡的受试物浓度。以每单位试验土壤干重所含的受试物量

表示。

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3.4

全部致死浓度totallylethalconcentration

LCioo

在给定的时间内造成100%受试生物死亡的最低受试物浓度。以每单位试验土壤干重所含的受试

物量表示。

3.

最低可观察效应浓度lowestobservedeffectconcentration；LOEC

能对受试生物产生统计学意义上的显著效应(/><0.05)的最低受试物浓度。以每单位试验土壤干

重所含的受试物量表示。通常所有高于LOEC的试验浓度都应产生与对照组相比具有统计学意义差

异的毒性效应。确定LOEC时，与上述要求偏离的任何情况都应在报告中进行解释说明。

3.6

无可观察效应浓度noobservedeffectconcentration；NOEC

直接低于LOEC,且未观察到任何毒性效应的最高受试物浓度。与对照组相比,N()EC对应的受

试物浓度在给定的暴露时间内对受试生物不产生统计学意义上的显著效应(〃<0.05)。

3.7

繁殖率reproductionrate

在试验期间内每条成蚓所产幼虫的平均数。

4受试物所需信息

受试物所需信息包括：

a)水中溶解度；

b)lgKow(土壤/水分配系数)，试验方法按GB/T21851.GB/T27860；

c)蒸气压；

d)挥发；

e)在土壤中的其他坏境行为，如光解和水解速率等。

5原理

将成蚓暴露于混合有不同浓度受试物的人工土壤中，试验可分为两步：当缺乏充分的信息时应首先

开展预试验,暴露两周以致死率作为主要的评价终点。在正式的繁殖试验中，应同时评估亲本繁殖的幼

体量和存活亲本的数量。正式试验的时间为6周。试验开始3周后，应移去成蚓并记录其形态上的变

化。6周后，计算成蚓产茧后孵化得到的子代数量。通过比较含受试物的试验组与空白对照组中线蚓

的繁殖量，确定NOEC和/或EC.r(如EC—ECQ：即采用回归模型估算导致繁殖率下降x%时的受试

物浓度。应使得EQ(如EC1o,EC5o)包括在试验浓度范围内，以便通过内插法而非外推法得出EC”。

6参比物

可定期开展参比物试验，也可在每批试验中同时开展以验证不同时期试验生物的反应未发生显著

变化。苯咪氨甲酯可作为参比物，已知该物质可对线蚓的存活和繁殖产生影响=幻。已充分获知毒性数

据的其他化学品也可用作参比物。

苯咪氨甲酯制剂，活性成分含量为360g/L(32.18%),已通过比对试验得到验证⑶。比对试验中，

苯咪氨甲酯对线蚓繁殖的EC：。为1.2mg+0.8mg活性成分/kg干重为。若试验组别中包括了阳性参

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比物，可采用一个浓度进行试验且该浓度组的平行数应与空白对照组一致。对于苯咪氨甲酯，试验浓度

宜为1.2mg活性成分/kg干重（受试物为液态制剂）。

7仪器设备

试验容器由玻璃或其他化学惰性材料制成，如体积为200mL〜250rnL,直径cm的玻璃瓶。试

验容器应带有透明的瓶盖（如玻璃或聚乙烯盖），以便光线透过。瓶盖在减少水分蒸发的同时可允许土

壤和空气之间存在气体交换。

除了常规设备外还应包括的仪器设备：

a）干燥箱；

b）体视显微镜；

c）pH计和光度计；

d）精密天平；

e）控温装置；

f）控湿装置（若暴露容器有盖子则不必）；

g）培养箱或者装有空调的小房间；

h）银子、弯钩、小环；

）光照池。

8试验系统

人工土壤的制备

8.1.1人工土壤的配方

本试验所需的人T土壤配方如下所示，配制方法按GB/T21809JSO11268-2（基于干重，105C烘

干至恒重）：

a）10%的泥炭土，风干后磨碎至所需粒径（粒径范围=2mm±1mm）；试验前，宜检查新配制的

泥炭土是否适用于线蚓的培养；

b）20%的高岭土（其中高岭石的含量宜在30%以上）；

c）约0.3%〜1.0%的碳酸钙（CaC（）:j粉末，分析纯），用来调节初始pH至6.0+0.5,人工土壤中

碳酸钙的添加量主要依据泥炭土的质地/性质而定；

d）约70%风干的石英砂（根据CaC（）:j的添加量而定），粒径在50pm〜200卩m范围内的石英砂

的含量应大于50%。

&1.2人工土壤的适用性及制备方法

在使用所配制的人工土壤进行正式试验之前，应确定其适合用于线蚓的培养,并且确保能够达到试

验有效性的标准。宜在试验前开展以下方式的检查以确保试验不会因为人工土壤中有机碳含量的降低

而受到影响，例如，将泥炭土的含量降至4%〜5%,并相应地增加石英砂的含量。若采用该方式降低有

机碳含量,则可能使土壤（有机碳）对受试物的吸附性下降从而导致线蚓对该受试物的可利用性增大。

经证实，当采用有机碳含量（如2.7%）⑷低于上述标准的田间土壤开展试验时，能够满足试验有效性中

关于白线蚓繁殖量的要求。采用泥炭土含量为5%的人T土壤也可满足上述要求。

若使用天然土壤进行其他试验（如高级试验），该土壤的适用性以及试验结果的有效性仍然需要

确认。

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组成人丁土壤的各干燥组分应至少在试验开始前一周充分混合（如采用实验室用的大型搅拌器）。

混匀的土壤应存放至少2d以确保土壤的酸度达到平衡。测定pH时，将土壤与1mol/LKC1或

0.01mol/LCaCl2按照1:5的比例混合（参见附录A）时。若试验土壤偏酸并超岀了规定的酸碱范围，

可通过添加适量CaC（）:j进行调整；若试验土壤偏碱，则可通过添加除CaC（）:j之外的其他组分进行

调整。

参照附录B测定人工土壤的最大持水量。在试验开始前1d〜2d,对干燥的土壤进行预湿润处理，

向土壤中加入足量的去离子水使得土壤含水量约至最终含水量的一半，最终含水量为土壤最大持水量

的40%〜60%。试验开始时根据试验设置的处理组（如需要，以及参比物试验组）和对照组的数量将经

过预湿处理的土壤分成若干份。通过添加受试物溶液或去离子水调节土壤的含水量至最大持水量的

40%〜60%。试验开始和结束时测定土壤含水量（105°C烘干至恒重）。含水量应处于线蚓生长的最适

范围内。可通过手指轻轻挤压土壤的方法来粗略地检查其含水量。若土壤含水量适中，则经过挤压后

手指间余有少量水分（小水滴）。

&2受试生物

&2.1受试生物的选择

受试生物种宜为白线蚓｛Enchytraeusalbidus）,属于环节动物门，寡毛目，线蚓科。白线蚓是线蚓

科中体型最大的种之一，体长最长可达3.5cm3］。白线蚓是世界广布种，常见于海洋、淡水以及陆地，

主要生活在腐烂的有机质（海藻、堆肥）当中，鲜见于草地阴。其广泛的生态耐受性和某些形态上的变化

表明其存在不同的类群。

其他的线蚓种也可用于试验，例如E.buchholzi或E.cryfiticus（.参见附录C）。若试验中使用了其

他线蚓种，应对这些种进行准确鉴定，并在报告中提供选择该受试物种的理论依据。

&2.2受试生物的准备

白线蚓通常作为鱼饵出售。获得白线蚓后应检查其是否受到其他物种（通常是更小的物种）污

染［9'10］o若存在污染，应将所有的白线蚓置于培养皿中用水清洗。将体型大的成蚓挑选出来（通过体视

显微镜镜检）作为重新培养用的亲本，其他的蚓虫弃之不用。白线蚓（E.aUndus）在多种有机质中均易

于培养（参见附录D）。在33d（18°C）〜74d（12°C）内可发育成熟⑷，生命周期较短。只有当白线蚓在

实验室内培养至少5周（一代）未出现任何问题后,方可将其用于试验。

试验应选用成蚓，其环带区具有卵（白点），体长相近（约1cm）0不要求选择同一时期培养的线蚓。

若线蚓未在同一类型的土壤中，或未在与最终试验相同的条件下（包括饲喂条件）繁殖培养，则应先

驯养1d〜3do选取超过试验所需的大量成蚓对其进行驯养，以发现并弃除受损或其他不适用的个体。

在驯养末期，挑选出怀卵和无异常行为表现（如试图逃离驯养土壤）的蚓虫用于试验。用精密的银子、小

钩或小环将蚓虫轻轻移入装有少量淡水的培养皿中。由于去离子水、去矿物质水或自来水均有可能对

蚓虫造成伤害，因此可参考GB/T21828［⑴中的方法配制淡水。采用体视显微镜对蚓虫进行镜检，弃除

未怀卵的个体。仔细去除可能影响线蚓驯养的蛾虫或跳虫。未用于试验的健康蚓虫可重新放回原基质

中继续驯养。

&3受试物的添加

&3.1水溶性受试物

采用去离子水配制受试物溶液，配制量应满足一个试验浓度组中所有平行的使用。应采用合适的

水量配制以达到试验含水量的要求，即土壤最大持水量（WHO的40%〜60%。分别将每个浓度的试

验溶液与经过预湿处理的同一批土壤充分混匀，再将混合好的土壤分装入试验容器。

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&3.2难溶于水的受试物

对于难溶于水但易溶于有机溶剂的化学品，可将受试物溶解于尽可能少量的溶剂中（如丙酮）。只

可使用挥发性溶剂。将溶剂喷洒在少量石英砂上（如2.5g石英砂）或与石英砂混合，再将石英砂放置

在通风橱中至少1h,通过挥发去除有机溶剂。向土壤中添加适量的去离子水达到所需的含水量后，将

石英砂与受试物混合物加入并充分混匀。将最终的土壤混合物分装至试验容器。

通常情况下受试物的浓度不应高于1000mg/kg干重土壤。但若为了达到某些特殊的试验目的，

也可采用更高的浓度进行试验。

&3.3难溶于有机溶剂的受试物

对于难溶于水和有机溶