GB/T 36757-2018 M-MLV反转录酶

ICS07.080

C27

国

中华人民共和国国家标准

GB/T36757-2018

M-MLV反转录酶

M－岛1LVreversetranscriptase

2018-09-17发布2019-04-01实施

国家市场监督管理总局峪非

中国国家标准化管理委员会0(..'I(J

GB/T36757-2018

目次

皿

引言………………...］＿~「

1范围－

2规范性引用文件－

3术语和定义·

4技术要求－

5检验方法…·

6包装、运输及贮存…………………………2

7保质期……………·…2

附录A（规范性附录）M-MLV反转录隅隅活力检测

附录B（规范性附录）核酸外切陪检测

附录c（规范性附录）核酸内t1J陌检测

I

GB/T36757-2018

附录B

（规范性附录）

核酸外切酶检测

B.1原理

由于BamHI切开DNA双链产生一对勃性末端，其各有5个碱基失去互补碱基形成突内单链，它

易受核酸外切酶作用丢失若干个碱基乃至形成平末端；如果将此DNA连接后再用BamHI酶切，结果

是无法切开。如果该位点是在外显子区或编码区，即意味其对应的氨基酸序列发生变化，乃至某些生物

性状发生改变。例如质粒pBR322所含BamHI识别位点是在其抗匹｜环素基因上，如果使用被核酸外

切酶污染的样品BamHI过量长时程切荆pBR322，然后再连接闭环后重新转化受体菌，该菌在含四环

素培养基上无法生长，而没有这样陪切的pBR322转化菌能够生长。又如质粒pUC19所含BamHI位

点居于编码LacZ的α互补肤上，若发生前述状况，就会导致该肤链的氨基酸序列变化，最终在含异丙

半乳糖节’（IPTG）和冉半乳糖节酶的LB培养基土由原本是蓝斑变成向斑。如果向斑数目占到

基硫代

总菌斑数的10%以上，就判定该样品已有核酸外切酶污染。

B.2仪器和设备

B.2.1恒泪水浴槽。

B.2.2台式离心机。

B.2.3届净丁，作台。

B.2.4恒泪培养箱。

B.3材料

B.3.1高纯CCCpUC19DNA。

B.3.2T4DNA连接隅。

B.3.310×T4DNA连接陌缓冲液：500mmol/LTri日’HCl缓冲液（pH7.肘，100mmol/LMgz+,

10mmol/LATP,100mmol/LDTTO

B.3.4LB培养液。

B.3.5氯仿－异戊醇（24:1，体积比）。

B.3.6大肠杆菌DH5α（感受态）。

B.3.7LB平版［含自－半乳糖梓陪，异丙基硫代半乳糖节。PTG），氨节青毒素］。

B.4实验步骤

B.4.1长时程过量酶切

取10pg高纯CCCpUC19DNA置于一只微量离心管中，加入20p.L10×BamHI缓冲液和1

150,uL水，充分混匀后平均分成A和B两管；A管如l入5p.LBamH1(50U~100U）和5p.L水，达总

体积10011L;B管加入5µLBamH1(50U~100U）和511LM-MLV反转录陌Clvg/vU。棍匀后置

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GB/T36757-2018

于37℃水浴槽，1h后各取出40µL，其中20µL（标记Al号和Bl号）待电iJJ<检测，另2011L（标记

AZ号和BZ号）待连接及蓝内斑计数；所剩60µL继续酶切达10h以上，又将它各均分为3管，分别标

记A3,B3、A4、B4、A5,B5号。

B.4.2电泳

B.4.2.1取出ALBl、A3,B3号管，加入载样缓冲液，准备电泳检测。

B.4.2.21.5%琼脂糖，电泳电压5V/cm~10V/cm，当澳酷蓝线到达凝胶版2/3时停止电泳，取州凝

胶版置于紫外透光分析仪观察和拍照。

B.4.3连接

B.4.3.1回收DNA

取出A2,B2,A4,B4、A5,B5号管，各加入20µL氯仿－异戊醇先脱去杂蛋白，再沉淀出DNA，并真

空干燥样品。

B.4.3.2连接反应

每管力iJ人2µL10×T4DNA连接酶缓冲液，2UT4DNA连接隅，加入水达总体积20µL，混匀后

置于1s·c水泊槽8h。

B.4.3.3转化与铺板

B.4.3.3.1将感受态菌液加入含连接处理过的DNA微量离心管内，轻混，置于4℃冰浴槽0.5h以上。

B.4.3.3.2将上述6只微量离心管移到42℃水浴中热击2min，迅即取出再置于4·c冰泊槽0.5h

以上。

B.4.3.3.3向上述6只做量离心管各加入1mLLB培养液，轻混，置于37℃水浴槽lh。

B.4.3.3.4将18块｜音｜态LB版，分别标上A2,B2,A4,B4,AS,BS号，每号均有3块板；在超净了作台铺

椒，每版加入上述菌液20011L；待版t菌液不会流动时，翻转平板，置于37·c恒泪培养箱8h以上。

B.4.3.3.5计算每块板蓝内斑数量，再算州每号管对应的每