GB/T 21675-2008 非洲马瘟诊断技术

ICS”．220

B41

囝雪

中华人民共和国国家标准

21675--2008

GB／T

非洲马瘟诊断技术

forAfricanhorsesickness

Diagnostictechniques

2008—06-0

2008—04—09发布1实施

宰瞀徽鬻瓣警箍警瞥霎发布中国国家标准化管理委员会“”。

21675--2008

GB／T

刖置

本标准的附录A、附录B为规范性附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心。

本标准主要起草人：包静月、王淑娟、吴}监三、王志亮、宋翠平、封启民。

21675--2008

GB／T

引言

horse

非洲马瘟(African

肠孤病毒科环状病毒属的非洲马瘟病毒(AHsV)引起，以呼吸系统和循环系统变化为特征，常使马、骡

致死。至少有两种库蠓属节肢动物传播本病。该病有9个血清型。《中华人民共和国动物防疫法》将本

病列为一类动物疫病，世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。

本标准诊断技术内容包括临床症状、病理变化、病原鉴定和血清学试验。

本标准主要参考OIE《哺乳动物、禽、蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》(2000年版)，并结

合我国的研究成果制定的。

Ⅱ

GB／T21675--2008

非洲马瘟诊断技术

1范围

本标准规定了非洲马瘟(AHS)的临床诊断、病原鉴定和血清学试验技术的要求。

本标准适用于马、骡和其他马科动物非洲马瘟的检疫。

2临床症状

2．1最急性型或肺型

症状急性发作，潜伏期3d～5d，特征为严重的渐进性呼吸道症状，初期仅显发热反应，最高体温可

d～2

达40。C～41"C，持续l

d就降至常温，之后出现不同程度的呼吸困难，可见前腿分开，头前伸，鼻孔

扩大。通常出汗较多，最后可见痉挛性咳嗽，同时从鼻孔流出泡沫样黄色液体。以其自身的浆液性液体

而溺死。这种病型康复率不到5％。

2．2亚急性型或水肿型、心型

d～14d～6

病初有发热反应(39℃～41℃)。潜伏期7d。发热持续3d，发热后期，出现特征性水

肿。水肿首先出现于颈部、眶上窝和眼睑，以后可扩展至嘴唇、面颊、舌部、下颌骨间、咽喉区，有时皮下

水肿从颈部至胸部不等，严重时胸部和肩部也出现水肿。晚期可见结膜和舌腹侧、皮下出血点。最后变

d～8d～

得烦躁不安，死于心力衰竭。一般在发热反应后4d内死亡，死亡率约50％。康复动物于3

8d内水肿逐渐消失。

2．3急性或混合型

肺型和心型混合存在，临床不多见。潜伏期5d～7

d。病初肺部有轻微症状，然后头部和颈部出现

明显水肿，最后死于心力衰竭。或先出现亚急性型症状，然后突发最急性型典型呼吸困难和其他临床表

d～6

现。通常发热后3d死亡，死亡率超过80％。

2．4最温和型

d～14d～8

潜伏期5d，后期表现弛张热(396C～40。C)，持续5

d。可能出现结膜轻度出血、脉搏加

快、轻微厌食和精神抑郁。其他临床症状不明显。

3病理学诊断

最特征及最常见的病变是皮下和肌肉组织间胶样浸润，并以眶上窝和喉头尤为显著。胃底黏膜肿

胀一直延伸到小肠前部。咽、气管、支气管充满黄色浆液和泡沫，肺泡、胸膜下和肺间质水肿，约有Z／3

病例有急性水肿。亚急性病例，头部、颈部和肩都水肿严重。心内膜和心包膜有血点和出血瘀斑、心肌

变性。有些病例胸腔和心包积存大量黄白色一红色液体，淋巴结肿大、肝和胃出血。

4实验室诊断

4．1病原分离和鉴定

4．1．1试剂

4．1．1．1磷酸盐缓冲液(PBS)(见B．1．2)。

4．1．1．2含有青霉素链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)(见B．1．4)。

4．1．1．350％甘油一磷酸盐缓冲液(见B．1．3)。

4．1．1．4MEM(最低限度必需氨基酸营养液)完全营养液(见13．2．2)。

4．1．1．5MEM维持液(见B．2．3)。

21675--2008

GB／T

4．1．2样品采集

发热动物取抗凝血，死亡动物取2g～4g小块脾、肺和淋巴结，保存于4"C或放入50％甘油一磷酸盐

缓冲液中，4℃运送和保存。用含有青霉素链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)将组织块配成10％悬液后，供

分离。

4．1．3病毒分离

min后，加入

细胞系进行分离。肝素抗凝血液样品勿需稀释就可使用，将样品接种上述细胞，吸附60

MEM维持液。若用脾、肺等组织病料，则需磨碎，以含青霉素链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)或MEM完

d～18

全营养液制成10％的组织悬浮液。接种后12d可出现细胞病变效应(CPE)，如盲传三代仍无

CPE，则判为阴性。

4．1．4乳鼠分离

d～15

AHSV可用2窝1FI龄～3日龄乳鼠通过脑内接种进行分离。阳性病料接种3d后，乳鼠可

d～5d，

出现神经症状。取发病鼠脑，匀浆后，再脑内接种6只以上乳鼠。第二次传代的潜伏期应缩短为2

感染率为100％。

4．1．5反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)

以RT—PCR法检测AHSV的RNA。

4．1．5．1器材

PCR扩增仪，研钵和研杵，无RNA酶污染的1．5mL离心管和枪头。

4．1．5．2试剂

AAAATTCGGTTAGGA

4．1．5．2．1引物：正向引物S7P1(5'-GTTTG-3’)，反向引物$7P2

GTATTCGGTATT

(5’一GTAAGTG一3’)。

4．，．5．2．2Trizol。

4．1．5．2．3

75％乙醇(见第B．4章)。

4．1．5．2．4二乙基焦磷酰胺(DEPC)处理过的水(见第B．5章)。

4．1．5．2．5一步法RT-PCR试剂盒。

4．1．5．2．6

1％的琼脂糖凝胶(见第B．7章)

4．1．5．2．70．5×Tris碱一硼酸一乙二胺四乙酸(EDTA)(TBE)缓冲液(见第B．6章)。

4．1．5．2．82倍反应混合液。

4．1．5．2．9反转录酶和Taq酶混合物。

4．1．5．2．10去上清其他试剂：三氯甲烷(分析纯)、异丙醇(分析纯)。

4．1．5．3操作方法

4．1．5．3．1在一70℃预冷的灭菌研钵中加入1mLTrizol。

4．1．5．3．2取100mg病料，用灭菌的剪刀剪碎。用灭菌的镊子夹到加有Trizol的研钵中，充分研磨。

000

4．1．5．3．3将研磨好的组织匀浆转移到新的离心管中，离心12r／rain，10rain，4"12。

min～3

s，静置2rain。离心

4．1．5．3．4取上清，静置5rain。加入200pL三氯甲烷，振荡混匀15

12000rain，4℃。

r／rain，15

000

rain。离心12r／rain，

4．1．5．3．5取上清到新的离心管中，加等体积的异丙醇，混匀，静置10

10

rain，44C。

mL000min，4"C。

4．1．5．3．6去上清，加入175％乙醇，离心12r／rain，5

4．1．5．3．7按步骤4．1．5．3．6重复离心一次。

5

4．1．5．3．8去上清，室温干燥RNArain。

4．1．5．3．9加入100pLDEPC处理过的水溶解RNA。

4．1．5．3．10每管RT