YC/T 365-2010 烟草病毒的测定 逆转录-聚合酶链反应法

ICS65.160

X85

备案号:—

298412010

中华人民共和国烟草行业标准

/—

YCT3652010

烟草病毒的测定

逆转录聚合酶链反应法

-

ㅤㅤㅤㅤ

—

TobaccovirusdetectionReversetranscrition-olmerasechainreaction

ppy

2010-10-11发布2010-10-15实施

国家烟草专卖局发布

/—

YCT3652010

烟草病毒的测定

逆转录聚合酶链反应法

-

1范围

、

本标准规定了用逆转录聚合酶链反应法测定烟草种子幼苗及鲜烟叶样品中的烟草花叶病毒

-

()、()、()()。

马铃薯病毒黄瓜花叶病毒和烟草蚀纹病毒

TMVYPVYCMVTEV

、()、()、

本标准适用于烟草种子幼苗和鲜烟叶样品中烟草花叶病毒马铃薯病毒黄瓜

TMVYPVY

花叶病毒()和烟草蚀纹病毒()的测定。

CMVTEV

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅所注日期的版本适用于本

。,()。

文件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/—烟草及烟草制品转基因检测方法

GBT243102009

3术语和定义

ㅤㅤㅤㅤ

/—。,

GBT243102009界定的以及下列术语和定义适用于本文件为了便于使用以下重复列出了

/—中的一些术语和定义。

GBT243102009

3.1

聚合酶链式反应扩增nreactionamlification

olmerasechaip

py

()、、,

模板序列在含有种脱氧核糖核酸引物聚合酶等的反应体系中在仪器中

DNA4dNTPsDNA

、,。

通过多次高温变性退火和延伸的循环过程最终使目标DNA片段以几何倍数扩增

[/—,]

GBT243102009定义3.6

3.2

逆转录聚合酶链反应

-reversetranscrition-olmerasechainreaction

ppy

,,()()

提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRNA作为模板采用OliodT5.1或随机引物

g18

(),,

利用逆转录酶5.2反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增而获得目的基因或检测

基因表达。

3.3

阳性对照ositivecontrol

p

经鉴定为含有检测目标成分的对照烟草样品。

[/—,]

GBT243102009定义3.11

3.4

阴性对照neativecontrol

g

经鉴定为不含有检测目标成分的对照烟草样品。

[/—,]

GBT243102009定义3.12

1

/—

YCT3652010

3.5

试剂对照reaentcontrol

g

检测过程中与样品一起进行各种检测操作的试剂参照样品。

[/—,]

GBT243102009定义3.13

3.6

特异性secificit

py

,、。

特异检测某种物质并可将其与相似物质杂质或降解物分辨开来的能力

[/—,]

GBT243102009定义3.15

4试验要求

4.1防止污染

,,。

样品采集和样品研磨过程中操作人员应戴一次性手套且每处理一个样品应更换一次样品前处

、、,

理病毒RNA提取PCR扩增和电泳与凝胶观察等操作应在相互隔离的不同操作间中进行样品研磨

。、,

应在通风橱中进行用于提取和扩增的耗材用具在使用前均应灭菌移液器枪头和各种

RNAPCR

离心管应一次性使用。

4.2样品备份

,,,。

将样品随机分成三份一份为实验室样品一份为备用样品一份为保存样品

4.3对照设置ㅤㅤㅤㅤ

、。

试验中设置阳性对照阴性对照和试剂对照

4.4防止RNA降解

(),,

磨样前将研钵用液氮5.3充分预冻或将研钵洗净后放入-20℃以下冰箱备用器皿预先经1%

()。。

的DEPC5.4处理后并烘干样品RNA提取液应存放在-70℃以下的冰箱中

4.5安全防护

、;()()

所有试验操作过程中操作人员应穿工作服戴手套和口罩接触溴乙锭EB5.5时操作人员应戴

抗化学腐蚀的手套及口罩。

4.6有毒废弃物处理

含溴乙锭()的电泳液

4.6.1EB

按/—中处理。

GBT2431020094.5.1

()

含溴乙锭的凝胶

4.6.2EB

按/—中处理。

GBT2431020094.5.2

5试剂

,,

除非特别说明检测中仅使用分析纯化学试剂和双蒸水PCR反应体系应使用电阻率大于18.2×

2

/—

YCT3652010

6

·。,。

10Ωcm的超纯水各种缓冲液均应存放在4℃冰箱内各种酶液应存放在-20℃以下的冰箱内

()。

5.1OliodT

g18

逆转录酶()。

5.2M-MLV

5.3液氮。

焦碳酸二乙酯()。

5.4DEPC

溴乙锭()。

5.5EB

。

5.6Trizol

5.7三氯甲烷。

5.8异丙醇。

5.9Rnasefreewater。

-

5.10乙醇。

三羟甲基氨基甲烷碱()。

5.11TrisBase

5.12硼酸。

5.13蔗糖。

5.14二甲苯青FF。

5.15柠檬酸钠。

5.16氯化钠()。

NaCl

5.175×M-MLV逆转录酶缓冲液。

(、、、,/)。

5.18dNTPs液dATPdTTPdCTPdGTP各2.5mmolL

5.19核糖核酸酶抑制剂。

5.2010×PCRbuffer。

ㅤㅤㅤㅤ

5.21DNA聚合酶。

5.22琼脂糖。

5.23溴酚蓝。

6仪器设备

,。

6.1PCR仪控温精度为±0.3℃

,。

6.2紫外分光光度计波长精确至0.3nm

,,。

6.3电泳系统电压为50V~600V电流为10mA~400mA

,,。

6.4紫外分析仪对蛋白质的检测灵敏度大于等于0.02ng对DNA的检测灵敏度大于等于0.05ng

,。

6.5高速冷冻离心机最大离心力为30000g

,。

6.6微量离心机最大离心力为20000g

,。

6.7电子天平感量为0.001g

,。

6.8超低温冰箱温度为-40℃~-86℃

、、、、、,。

6.9微量移液器为10L20L50L100L200L1000L精度≤0.8%~1.0%

μμμμμμ

6

,·。

6.10超纯水器能产生电阻率大于18.2×10Ωcm的超纯水

7取样

7.1种子样品

(),、、、、

随机抽取约烟草裸种或袋包衣种子注明品种名称种子来源取样地点取样单位

5g2400g

3

/—

YCT3652010

、,,。

取样人日期等信息放入种子袋中送病毒鉴定机构进行鉴定

7.2幼苗及鲜烟叶样品

,,、、、

取株苗床期感病幼苗或片田间感病鲜烟叶放入样品袋中注明取样地点取样单位取样人

53

,()。

日期等信息用泡沫箱或保温瓶内置冰袋密封后直接送病毒鉴定机构进行鉴定

8检测方法

8.1样品前处理

8.1.1烟草种子

8.1.1.1烟草裸种

,,

从实验室样品中随机抽取约50mg烟草裸种转入两个已知质量的1.5mL的离心管中称取每个

离心管中烟草裸种的质量。

8.1.1.2烟草包衣种子

,,

从实验室样品中随机取约200g包衣种子用灭菌的纱布包裹包衣种子并用无菌水浸泡用灭菌纸

,,

吸干滤出的烟草裸种表面的水分转入两个已知质量的1.5mL的离心管中称取每个离心管中烟草裸

种的质量。

8.1.2幼苗及鲜烟叶样品ㅤㅤㅤㅤ

,,

从实验室样品中随机取患病部位样品约200mg转入两个已知质量的1.5mL离心管中称取样

品质量。

8.2RNA的提取

RNA提取的准备工作及注意事项参见附录A。

,,。()

将根据8.1称取的样品置于研钵中加入适量液氮将样品研磨至粉末状用微量移液器6.9移

(),,,

取的于研钵中在冷凝前应覆盖尽可能多的粉末样品继续研磨直至

1000LTrizol5.6Trizol

μ

。,,

Trizol重新液化且样品粉末悬浮在Trizol中将悬浮液转移至1.5mL的离心管中盖紧盖子在室温

,(),/,。

下静置5min然后用离心机6.5离心10min转速为12000rmin温度为4℃移取上清液于另外

,(),,,

洁净的1.5mL离心管中每毫升上清液需加入200L的三氯甲烷5.7盖紧盖子用力摇晃约15s

μ

,(),/,。

在室温下静置2min~3min然后用离心机6.5离心15min转速为12000rmin温度为4℃移取

,()(

上层水相于另外洁净的离心管中加入异丙醇和高盐溶液附录中

1.5mL0.25mL5.80.25mLB

),,,,(),

的第B.3章盖紧盖子摇晃均匀在室温下静置10min~30min然后用离心机6.5离心10min转

/,。,,

速为12000rmin温度为4℃弃去上清液用1mL体积浓度为75%的乙醇溶液洗涤沉淀物然后

(),/,。,

用离心机6.6离心10min转速为8000rmin温度为4℃弃去上清液沉淀物在室温下自然干燥

,(),()

10min~30min然后将沉淀物溶解于Rnasefreewater5.9中置于-70℃以下的冰箱6.8中

-

备用。

8.3RNA产量和纯度测定

参见附录C。

4

/—

YCT3652010

8.4病毒RNA逆转录

参见附录D。

8.5病毒PCR测定引物设计

8.5.1烟草花叶病毒测定引物

:’’

TMV-F5TACAGTATCACTACTCCATC3

:’’

TMV-R5AAGTTGCAGGACCAGAGGTCC3

,。

退火温度为其扩增产物片段长度为

59℃PCR462bp

8.5.2黄瓜花叶病毒测定引物

:’/’

CMV-F5AGTAGACATACTGTGACGCG3

:’’

CMV-R5TCGGCAAAGGATTAACTCG3

,。

退火温度为57℃其PCR扩增产物片段长度为564bp

马铃薯病毒测定引物

8.5.3Y

:’////’

PVY-F5TGCTTATCCAGTACTCACCCAGC3

:’///’

PVY-R5CCACGACACTATGAATCAAGGCC3

,。

退火温度为57℃其PCR扩增产物片段长度为720bp

ㅤㅤㅤㅤ

8.5.4烟草蚀纹病毒测定引物

:’’

TEV-F5CCAAGGATGAAAGGGGAAGT3

:’’

TEV-R5CCAAATAACCTAGTTCCACTG3

,。

退火温度为58℃其PCR扩增产物片段长度为533bp

8.6PCR反应体系及反应条件

参见附录E。

8.7扩增产物检测

参见附录F。

9结果判定

9.1阳性结果

,、,

观察电泳结果如果相对应病毒的阴性对照阳性对照和试剂对照均表现正常样本出现特异性片

,。

段且与阳性对照位置一致则可判定该样本带有该种病毒

9.2阴性结果

,、,

观察电泳结果如果相对应病毒的阴性对照阳性对照和试剂对照均表现正常样本未出现特异性

,。

片段则可判定该样本不带有该种病毒

5

/—

YCT3652010

9.3检测报告

检测报告应包含以下信息:

)送样单位与送样人;

a

)取样地点;

b

)样品的种类与状态;

c

)收样日期;

d

)检测的病毒种类;

e

)几种对照的表现;

f

)结果报告单的样式参见附录。

gG

ㅤㅤㅤㅤ

6

/—

YCT3652010

附录

A

()

资料性附录

RNA提取准备工作及注意事项

RNA提取准备工作及注意事项如下:

)、、、、,;

a试验用烧杯容量瓶药匙玻棒研钵和杵等需用锡箔纸包好并于160℃下干燥3h

)、,

微量移液器的吸头离心管和管等需在的溶液中浸泡然后进

b1.5mLPCR0.1%DEPC12h

,;

行高压湿热灭菌并于60℃~70℃下干燥3h~5h

),()();

cRNA提取过程中高盐溶液和乙醇5.10应使用含0.1%DEPC的超纯水高压灭菌配制

),。

d操作人员应戴口罩和手套不应对着试验材料说话

ㅤㅤㅤㅤ

7

/—

YCT3652010

附录

B

()

资料性附录

溶液的配制

B.15×TBE的配制

()()、(),/

用电子天平6.7称取TrisBase5.1154.000g硼酸5.1227.500g置于烧杯中加入0.5molL的

(),,,,

用超纯水溶解并定容至放入冰箱中保存用时稀释倍得到

EDTAH=8.020mL1000mL4℃5

p

1×TBE。

B.2溴酚蓝上样缓冲液的配制

(),,(),

称取蔗糖5.130.150g加入1%的溴酚蓝150L1%的二甲苯青FF5.14150L用超纯水溶

μμ

,。

解并定容至1000L放入4℃冰箱中保存

μ

B.3高盐溶液的配制

称取柠檬酸钠()和()溶于100mL超纯水中。

20.6405.157.020NaCl5.16

gg

ㅤㅤㅤㅤ

8

/—

YCT3652010

附录

C

()

资料性附录

RNA提取物的产量和纯度的测定方法

C.1紫外区波长扫描

(),。

用经DEPC处理的超纯水将紫外分光光度计6.2调零校正基线移取10LRNA提取液于比

μ

,,,

色皿中加入经处理的超纯水用移液器抽打混合液使之均匀用紫外分光光度计在

1990LDEPC

μ

,()。

波长范围扫描记录和波长处样品的吸光值

220nm~320nm260nm280nmOD

C.2RNA提取物产量的计算

根据260nm处的吸光值()计算RNA提取物的产量,值为相当于每毫升溶液中含有

ODOD1

50μg的RNA。

C.3RNA提取物的纯度计算

/,,

根据OD260OD280的比值估算RNA提取物纯度当比值为1.8~2.0时RNA提取物纯度较

;,。

好当比值小于1.8或大于2.2时需重新提取RNA

ㅤㅤㅤㅤ

9

/—

YCT3652010

附录

D

()

资料性附录

病毒RNA逆转录

在的管中依次加入超纯水,/的()(),提取

0.5LPCR8L20molLOliodT5.10.5LRNA

μμpμg18μ

;()(),;

物放入仪中变性取出管置于冰浴上加入逆

2LPCR6.110min70℃PCR5min5×M-MLV

μ

转录酶缓冲液(),/的(),/的核糖核酸酶抑制剂()

5.174L10mmolLdNTPs5.183L40UL5.19

μμμ

,/(),;(),

的逆转录酶混合均匀放入微量离心机中室温离心

0.5L200ULM-MLV5.21L6.610s

μμμ

/;,。

转速为2000rmin取出立即置于PCR仪中42℃条件下反应1h

ㅤㅤㅤㅤ

10

/—

YCT3652010

附录

E

()

资料性附录

PCR反应体系及反应条件

E.1PCR反应液的配制

(),/

在的管中加入加入病毒病检测上下游

0.5LPCR10×PCRbuffer5.202.5L10molL

μμpμ

,/(),,

特异性引物各加入的聚合酶加入病毒反转录产物加

1L2.5ULDNA5.210.5LRNA5L

μμμμ

入超纯水16L。

μ

E.2PCR扩增

,(),/;

将配制好的PCR反应液充分混匀放入微量离心机6.6中离心10s转速为2000rmin取出立

;。

即放入PCR仪中按表E.1设置反应条件进行PCR扩增

表E.1反应条件

温度时间目的循环次数

95℃5min预变性1

94℃30sㅤㅤㅤㅤ变性

()

各病毒的退火温度见8.540s退火36

72℃30s延伸

72℃7min终末延伸1

11

/—

YCT3652010

附录

F

()

资料性附录

扩增产物检测

(),()

称琼脂糖于三角瓶中加电泳缓冲液附录的第章

1.500g5.22100mL1×TBEBB.1

,;,,,

100mL加热至琼脂糖完全熔解加溴乙锭5L摇匀冷却至45℃后倒入已经放好梳子的胶模中琼

μ

;(),

脂糖完全凝结后拔出样梳子将凝胶放入已倒入1×TBE电泳缓冲液的电泳仪6.3中取10L扩增

μ

(),,;/

产物加上样缓冲液附录的第章点样并点入标准分子量电泳电压为

0.5LBB.2DNA1Vcm~

μ

/,(),,,()

10Vcm待溴酚蓝5.23电泳到凝胶的中间位置时停止电泳取出凝胶用紫外分析仪6.4观察电

泳结果。

ㅤㅤㅤㅤ

12