DB33/T 2247-2020 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法
DB33/T 2247-2020 Duck Taibouchi virus RT-PCR and real-time quantitative RT-PCR detection methods
基本信息
发布历史
-
2020年03月
研制信息
- 起草单位:
- 起草人:
- 出版信息:
- 页数:8页 | 字数:- | 开本: -
内容描述
ICS65.020.30
B43
DB33
浙江省地方标准
DB33/T2247—2020
鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量
RT-PCR检测方法
MethodofRT-PCRandthereal-timeRT-PCRforthedetectionofducktembusu
virusdisease
2020-03-03发布2020-04-03实施
浙江省市场监督管理局发布
DB33/T2247—2020
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。
本标准由浙江省农业农村厅提出。
本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:浙江省动物疫病预防控制中心、浙江省农业科学院畜牧兽医研究所。
本标准主要起草人:云涛、徐辉、周彩琴、张存、赵灵燕、余斌、吴赟竑、张传亮、吴雪军、黄晓
兵、冯肖肖、华炯钢、吕见涛、张娟敏、鲍伟华。
I
DB33/T2247—2020
鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法
1范围
本标准规定了鸭坦布苏病毒的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR的实验条
件、操作步骤和结果判定等要求。
本标准适用于鸭坦布苏病毒核酸的检测。
2术语和定义
2.1
鸭坦布苏病毒(DuckTembusuVirus,DTMUV)
属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类、Ntaya病毒群,可引起鸭、鹅产蛋下降,雏鸭、雏鹅发病
死亡。
3实验条件
3.1主要仪器设备
3.1.1PCR仪。
3.1.2荧光定量PCR仪。
3.1.3微量移液器。
3.1.4组织匀浆器。
3.1.5电泳仪。
3.1.6电泳槽。
3.1.7水浴锅。
3.1.8紫外凝胶成像系统。
3.1.9高速台式低温离心机。
3.1.10生物安全柜。
3.2试剂
3.2.10.01M磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH7.4PBS):称取8.0gNaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4•12H2O、
0.2gKH2PO4,将上述试剂溶于800mL去离子水中,充分搅拌溶解,滴加浓盐酸将pH调节至7.4,然
后加去离子水定容至1L,高温灭菌30min,室温保存。
3.2.2氯仿。
3.2.3异丙醇。
3.2.4焦炭酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌去离子水:用DEPC50μL,加超纯水至100mL,室温过夜,
121℃高压灭菌15min,分装到1.5mLDEPC处理过的离心管,冻存备用。
3.2.575%乙醇:取新开启的无水乙醇75mL,加DEPC水至100mL,混匀,-20℃预冷。
1
DB33/T2247—2020
3.2.6溴化乙锭(EB):取1.0g溴化乙锭,加去离子水,定容至100mL。充分溶解后的溴乙锭溶
液转移至棕色瓶中,室温避光保存,其工作浓度为0.5μg/mL。
3.2.71×TAE缓冲液:取242g羟基甲基氨基甲烷(Tris)、37.2g二水乙二铵四乙酸二钠、57.1mL
冰乙酸,加去离子水定容至1L,配置成50×TAE电泳缓冲液;量取20mL的50×TAE电泳缓冲液,加
入去离子水定容至1L,室温保存。
3.2.81%琼脂糖凝胶:称取1.0g琼脂糖,加入1×TAE电泳缓冲液100mL,轻轻混匀后加热,使琼脂
糖完全熔化。待琼脂糖胶冷至50℃~60℃时,加EB溶液(终浓度0.5μg/mL)或5μL核酸染料,摇
匀后倒入制胶板中,厚度为3mm~5mm,室温凝固后取下电泳梳子,备用。
3.2.9DNA相对分子质量标准物Marker:DL2000。
3.2.1010×加样缓冲液:称取25g聚蔗糖、0.1g溴酚蓝、0.1g二甲苯青,加入灭菌双蒸水定容至
100mL。
3.2.11商品化的一步法实时荧光RT-PCR反应试剂盒。OneStepPrimeScript™RT-PCRKit(Perfect
RealTime,TAKARA),含有RT-PCR缓冲液,酶混合物,dNTP混合
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