DB33/T 2247-2020 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法

DB33/T 2247-2020 Duck Taibouchi virus RT-PCR and real-time quantitative RT-PCR detection methods

浙江省地方标准 简体中文 现行 页数:8页 | 格式:PDF

基本信息

标准号
DB33/T 2247-2020
标准类型
浙江省地方标准
标准状态
现行
中国标准分类号(CCS)
国际标准分类号(ICS)
发布日期
2020-03-03
实施日期
2020-04-03
发布单位/组织
浙江省市场监督管理局
归口单位
-
适用范围
-

发布历史

研制信息

起草单位:
起草人:
出版信息:
页数:8页 | 字数:- | 开本: -

内容描述

ICS65.020.30

B43

DB33

浙江省地方标准

DB33/T2247—2020

鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量

RT-PCR检测方法

MethodofRT-PCRandthereal-timeRT-PCRforthedetectionofducktembusu

virusdisease

2020-03-03发布2020-04-03实施

浙江省市场监督管理局发布

DB33/T2247—2020

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。

本标准由浙江省农业农村厅提出。

本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。

本标准起草单位:浙江省动物疫病预防控制中心、浙江省农业科学院畜牧兽医研究所。

本标准主要起草人:云涛、徐辉、周彩琴、张存、赵灵燕、余斌、吴赟竑、张传亮、吴雪军、黄晓

兵、冯肖肖、华炯钢、吕见涛、张娟敏、鲍伟华。

I

DB33/T2247—2020

鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了鸭坦布苏病毒的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR的实验条

件、操作步骤和结果判定等要求。

本标准适用于鸭坦布苏病毒核酸的检测。

2术语和定义

2.1

鸭坦布苏病毒(DuckTembusuVirus,DTMUV)

属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类、Ntaya病毒群,可引起鸭、鹅产蛋下降,雏鸭、雏鹅发病

死亡。

3实验条件

3.1主要仪器设备

3.1.1PCR仪。

3.1.2荧光定量PCR仪。

3.1.3微量移液器。

3.1.4组织匀浆器。

3.1.5电泳仪。

3.1.6电泳槽。

3.1.7水浴锅。

3.1.8紫外凝胶成像系统。

3.1.9高速台式低温离心机。

3.1.10生物安全柜。

3.2试剂

3.2.10.01M磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH7.4PBS):称取8.0gNaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4•12H2O、

0.2gKH2PO4,将上述试剂溶于800mL去离子水中,充分搅拌溶解,滴加浓盐酸将pH调节至7.4,然

后加去离子水定容至1L,高温灭菌30min,室温保存。

3.2.2氯仿。

3.2.3异丙醇。

3.2.4焦炭酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌去离子水:用DEPC50μL,加超纯水至100mL,室温过夜,

121℃高压灭菌15min,分装到1.5mLDEPC处理过的离心管,冻存备用。

3.2.575%乙醇:取新开启的无水乙醇75mL,加DEPC水至100mL,混匀,-20℃预冷。

1

DB33/T2247—2020

3.2.6溴化乙锭(EB):取1.0g溴化乙锭,加去离子水,定容至100mL。充分溶解后的溴乙锭溶

液转移至棕色瓶中,室温避光保存,其工作浓度为0.5μg/mL。

3.2.71×TAE缓冲液:取242g羟基甲基氨基甲烷(Tris)、37.2g二水乙二铵四乙酸二钠、57.1mL

冰乙酸,加去离子水定容至1L,配置成50×TAE电泳缓冲液;量取20mL的50×TAE电泳缓冲液,加

入去离子水定容至1L,室温保存。

3.2.81%琼脂糖凝胶:称取1.0g琼脂糖,加入1×TAE电泳缓冲液100mL,轻轻混匀后加热,使琼脂

糖完全熔化。待琼脂糖胶冷至50℃~60℃时,加EB溶液(终浓度0.5μg/mL)或5μL核酸染料,摇

匀后倒入制胶板中,厚度为3mm~5mm,室温凝固后取下电泳梳子,备用。

3.2.9DNA相对分子质量标准物Marker:DL2000。

3.2.1010×加样缓冲液:称取25g聚蔗糖、0.1g溴酚蓝、0.1g二甲苯青,加入灭菌双蒸水定容至

100mL。

3.2.11商品化的一步法实时荧光RT-PCR反应试剂盒。OneStepPrimeScript™RT-PCRKit(Perfect

RealTime,TAKARA),含有RT-PCR缓冲液,酶混合物,dNTP混合

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