DB52/T 1528-2020 紫苏品种鉴定技术规程SSR标记法

ICS65.020.01

CCSB36

DB52

贵州省地方标准

DB52/T1528—2020

紫苏品种鉴定技术规程SSR标记法

Protocolfortheidentificationofperillavarieties—SSRmarkermethod

2020-11-13发布2021-03-01实施

贵州省市场监督管理局发布

DB52/T1528—2020

目次

前言II

1范围1

2规范性引用文件1

3术语与定义1

4原理1

5仪器设备及试剂2

6溶液配制2

7引物信息2

8参照品种准备2

9操作步骤2

10数据记录与统计3

11结果判定4

附录A（资料性）主要仪器设备及试剂5

附录B（资料性）溶液配制7

附录C（资料性）推荐引物名单及序列9

附录D（资料性）参照品种等位变异位点11

附录E（资料性）参照品种名单15

I

DB52/T1528—2020

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起

草。

本文件由贵州省农业农村厅提出并归口。

本文件起草单位：贵州省油菜研究所。

本文件主要起草人：沈奇、温贺、王仙萍、徐静、商志伟、杨森、杜才富、陈俊琨、田飞、汤勇。

II

DB52/T1528—2020

紫苏品种鉴定技术规程SSR标记法

1范围

本文件规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeat，SSR）标记法进行紫苏资源材料及品

系品种鉴定的原理、仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息、参照品种准备、操作步骤、数据记录与统

计、结果判定等。

本文件适用于紫苏种质资源、品系品种的SSR标记鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

NY/T2494植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南紫苏

3术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

推荐引物RecommendedPrimer

品种鉴定中优先选用的一套SSR引物，具有多态性高，重复性好等综合特性。

3.2

参照品种ReferenceVariety

具有所用SSR位点上不同等位变异的品种。参照品种用于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器

设备的系统误差。

3.3

SSR指纹图谱SSRFingerPrint

品种或材料特征性的SSR变异位点集合，代表着以品种特有的基因组DNA中简单重复序列特征。

4原理

由于不同紫苏品种遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数存在差异，这种差异可通

过DNA提取、PCR扩增以及聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或毛细管电泳荧光检测进行检测，从而能够区分

紫苏资源材料及品系品种。

1

DB52/T1528—2020

5仪器设备及试剂

详见附录A。

6溶液配制

参照附录B的要求执行。

7引物信息

推荐引物名单及序列参见附录C，推荐引物等位变异等相关信息参见附录D。

8参照品种准备

参见附录E。

9操作步骤

9.1材料准备

随机取5个单株的组织或器官（种子，幼苗，叶片，苞叶，花，果穗等）。

9.2DNA提取

CTAB提取法：幼苗或叶片500mg，置于研钵，加液氮充分研磨，或取种子充分磨碎，称取100mg移

入2mL离心管；每管加入600μL，65℃预热的CTAB提取液，充分混合，65℃保温60min，期间多次颠

倒混匀；每管加入等体积的三氯甲烷／异戊醇混合液，充分混匀，静置10min；12000r离心15min后，

吸取上清液至一新离心管，再加入等体积的三氯甲烷／异戊醇混合液，充分混匀，静置10min，12000r

离心15min。吸取上清液至一新离心管，加入2倍体积的预冷乙醇，置于-20℃冰箱过夜放置后12000r

离心15min，弃上清液；加入70%乙醇，旋转离心管数次，弃去乙醇，室内干燥沉淀6h以上；加入100μL

超纯水或TE缓冲液，充分溶解后备用。

注：以上为推荐的DNA提取方法，其他达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法均适用。

9.3PCR扩增

9.3.1引物选择

选择附录C中引物进行检测。

9.3.2反应体系

各试验材料的DNA浓度稀释至50ng/μL使用。10μL反应体系各组分推荐含量如下：10×Buffer

1.0μL，Mg2+0.8μL(1.5mmol·L-1)，dNTPs0.2μL(0.225mmol·L-1)，TaqDNA聚合酶0.1μL，模板DNA1.0μL，

-1

引物各0.5μL（0.5μmol·L），ddH2O5.9μL。

2

DB52/T1528—2020

9.3.3反应程序

94℃预变性3min，每个循环94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，共36个循环，72℃，

10min，10℃保持。

9.4聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（PAGE）

9.4.1PAGE胶制备

电泳胶板洗净，用蒸馏水和无水乙醇分别淋洗并晾干。在长胶板上均匀涂抹1.5mL硅化液，短胶板

上均匀涂抹1mL反硅化液，5min后用95%乙醇擦除多余的硅化液和反硅化液。将玻璃胶板装配好并以

0.4mm边条隔开。配制80mL变性凝胶液，从制胶夹底部小孔缓慢注入，插入梳子并加夹子保护，凝聚

2h后即可电泳。

9.4.2电泳分离

将电泳槽底部的制胶夹板取下，擦净电泳槽玻璃外侧并将其垂直固定于底座上，上槽加1×TBE缓冲

液1000mL，下槽加同样浓度的电泳缓冲液500mL，将梳子拔出后立即冲洗点样孔。接通电源后，120W

电泳预热30min。在选择性扩增产物中加入等体积的上样缓冲液，95℃变性3min～5min后立即冰浴冷

却，上样2μL，70W～90W电泳2h左右，当二甲苯青跑过2/3胶板时中止电泳。

9.4.3染色与显影

电泳完毕，剥离下胶板，将其浸入2L固定液，摇床在速度20r/min下摇动20min或至指示剂消失

为止，然后用去离子水漂洗胶板2次，每次不少于10min。然后转至2L染色液中染色，置于摇床速度

20r/min下摇动30min。取出胶板，在双蒸水中迅速漂洗10s，马上转入到2L的显影液中，置于摇床速

度20r/min下摇动至带型清晰可见后取出放回固定液中停止显影，然后用自来水漂洗5min，室温下自然

晾干，拍照保存。

9.5毛细管电泳荧光检测

分别取等体积稀释后的不同荧光标记扩增产物混合液1μL加入DNA分析仪96孔板中，各孔中分别加

入0.1μL内标及8.9μL去离子甲酰胺。样品变性5min取出置于冰上冷却10min，转速11000r/min离心

10s放置分析仪上。电泳检测按照仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序。

10数据记录与统计

10.1结果记录

纯合位点的基因型数据记录为X/X，杂合位点的基因型数据记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点上

两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点基因型数据记录为0/0。

示例1:扩增样品在某个位点上仅出现一个等位变异，大小为250bp，在该位点的基因型记录为

250/250。

示例2:扩增样品在某个位点上有两个等位变异，大小分别为245bp、250bp，在该位点的基因型记

录为245/250。

3

DB52/T1528—2020

10.2统计比较

样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段长度的形式表示。对于普通聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检

测法，每个扩增位点的等位变异与参照品种的等位变异片段大小进行比较，确定样品在该位点的等位变

异。对于毛细管电泳荧光检测方法，通过使用参照品种，消除同型号不同批次或不同型号DNA分析仪间

可能存在的系统误差，使用片段分析软件读取送检样品在该位点的等位变异。

11结果判定

当样品间差异位点数大于2，判定为“不同”；当样品间差异位点数等于l，判定为“近似”；当

样品间差异位点数等于0，判定为“极近似或相同”。

对利用附录C中30对引物仍未检测到2个差异位点数的样品，可进行田间种植鉴定。田间种植鉴定参

照NY/T2494进行判定。

4

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AA

附录A

（资料性）

主要仪器设备及试剂

A.1主要仪器设备

A.1.1PCR扩增仪。

A.1.2高压电泳仪：最高电压不低于2000V，具有恒电压，恒电流和恒功率功能。

A.1.3垂直电泳槽及配套的制胶附件。

A.1.4普通电泳仪。

A.1.5DNA分析仪。

A.1.6高速冷冻离心机：最大离心力不小于20000g。

A.1.7水平摇床。

A.1.8胶片观察灯。

A.1.9电子天平。

A.1.10微量移液器：规格分别为10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL，连续可调。

A.1.11磁力搅拌器。

A.1.12核酸浓度测定仪及紫外分光光度计。

A.1.13微波炉。

A.1.14高压灭菌锅。

A.1.15酸度计。

A.1.16水浴锅或金属浴：控温精度±1℃。

A.1.17冰箱。

A.1.18制冰机。

A.1.19凝胶成像系统或紫外透射仪。

A.2主要试剂

A.2.1十二烷基苯磺酸钠。

A.2.2聚乙烯吡咯烷酮。

A.2.3氯仿。

A.2.4异戊醇。

A.2.5乙二胺四乙酸二钠。

A.2.6三羟甲基氨基甲烷。

A.2.7盐酸。

A.2.8氢氧化钠。户

A.2.9氯化钠。

A.2.1010×Buffer缓冲液。

A.2.11dNTP。

A.2.12TaqDNA聚合酶。

A.2.13矿物油。

5

DB52/T1528—2020

A.2.14琼脂糖。

A.2.15DNA分子量标准。

A.2.16核酸染色剂。

A.2.17去离子甲酰胺。

A.2.18溴酚蓝。

A.2.19二甲苯青。

A.2.20甲叉双丙烯酰胺。

A.2.21丙烯酰胺。

A.2.22硼酸。

A.2.23尿素。

A.2.24亲和硅烷。

A.2.25剥离硅烷。

A.2.26无水乙醇。

A.2.27四甲基乙二胺。

A.2.28过硫酸胺。

A.2.29冰醋酸。

A.2.30冰醋酸。

A.2.31硝酸银。

A.2.32甲醛。

A.2.33DNA分析仪专用丙烯酰胺胶液。

A.2.34DNA分析仪专用分子量内标LIZ标记。

A.2.35DNA分析仪用光谱校准基质。

A.2.36DNA分析仪专用电泳缓冲液。

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BB

附录B

（资料性）

溶液配制

B.1DNA提取溶液的配制

-1

B.1.10.5mol·LEDTA溶液：186.1gNa2EDTA•2H2O800mL水中，用固体NaOH调pH至8.

0，定容至1000mL，高压灭菌。

B.1.21mol·L-1Tris-HCI溶液：60.55gTris碱溶于适量水中，加HCl调pH至8.0，定容至

500mL，高压灭菌。

B.1.30.5mol·L-1HCI溶液：25mL浓盐酸（36%-38%），加水定容至500mL。

B.1.45mol·L-1NaCl溶液：146gNaCl加水定容至500mL。

B.1.52％（w/v）CTAB提取液：0.5mol·L-1EDTA溶液40mL,1mol·L-1Tris-HCI溶液100mL,

5mol·L-1NaCl溶液40mL，CTAB20g定容至1000mL。

B.1.6TE缓冲液：1mol·L-1Tris-HCl5mL,0.5mol·L-1EDTA1mL，加HCl调pH至8.0，

定容至500mL。

B.1.7氯仿/异戊醇溶液：按24：1（V/V）的比例配置。

B.2PCR扩增溶液的配制

B.2.1dNTP：用超纯水分别配制A、G、C、T终浓度100mmol·L-1的储存液。各取20µl混合，用

超纯水720µl定容至终浓度2.5mmol·L-1的工作液。

B.2.2SSR引物：用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均40µmmol·L-1的储存液，等体积混合

成20µmmol·L-1的工作液。

注：干粉配制前应首先快速离心。

B.2.310×PCR缓冲液：500mmol·L-1KCI，100mmmol·L-1Tris-HCl，0.01%明胶，高压灭菌保存。

B.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制

B.3.140%PAGE胶：分别称取丙烯酰胺190g和甲叉双丙烯酰胺10g，定容至500mL。

B.3.26%变性聚丙烯酰胺胶溶液：称取尿素450g，10×TBE缓冲液100mL，40%PAGE胶112.

5mL，定容至1000mL。

B.3.3亲和硅烷缓冲液：49.75mL无水乙醇和250µL冰醋酸，加水定容至50mL。

B.3.4亲和硅烷工作液：在1mL亲和硅烷缓冲液中加入5µL亲和硅烷原液，混匀。

B.3.5剥离硅烷工作液：在98mL三氯甲烷溶液中加入2%二甲基二氯硅烷溶液，混匀。

B.3.610%过硫酸铵溶液：1g过硫酸铵溶于l0mL超纯水中，混匀。

B.3.710×TBE缓冲液：三羟甲基氨基甲甲烷（Tris碱）108g，硼酸55g，0.5mmol·L-1EDTA

（PH=8.0）溶液37mL，定容至1000mL。

B.3.81×TBE缓冲液：取10×TBE缓冲液500mL，加水定容至5000mL。

B.3.96×加样缓冲液：0.25g溴酚蓝，0.25g二甲苯青，分别加入98mL去离子甲酰胺，1mmol·L-1

的EDTA溶液（pH8.0)1mL，搅拌溶解。

7

DB52/T1528—2020

B.4银染溶液的配制

B.4.1固定液：100mL冰醋酸，加水定容至1000mL。

B.4.2染色液：称取2g硝酸银，加水定容至1000mL。

B.4.3显影液：取1000mL蒸馏水中，加入30g氢氧化钠和5mL甲醛，混匀。

注：除银染溶液的配制可使用符合GB/T6682规定的三级水外，试验中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682

规定的一级水。

8

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CC

附录C

（资料性）

推荐引物名单及序列

表C.1推荐引物名单及序列

上游引物下游引物

引物

长度温度长度

编号序列信息(5'-3')温度(°C)序列信息(5'-3')

（bp）(°C)(bp)

P14CGAGGCAATGCAAATAGGAT60.0620GTCGCTACGAGAACCAGGAG60.0120

P16GCTCCTCCTCCTCGCTTATT59.9520CACCACCTCCATCCCTCTAA59.9220

P19CGCTCTCCAAAGTTGAAACC59.8520GCTCCTGCTTTCTTCAAAGG59.2020

P25TAAATAACCCATGCAGCCCT59.4320CGATCGATTATTCAACAACATGA59.8523

P26GCCTTTAACGCCAGAGAGTG60.0220TTCCTTTTTCCGAGCTTCTG59.5620

P31GCTCTTTCAACGATTGGCTC59.9620CAGGGTTTTGGTGATTTAAGC58.6221

P32TGAAAATCTGTGCTCCCCTT59.6720GACTGGATCTGCTCTCTGGG59.9520

P33AACAATTCCGAACCCAAAAC58.7920GCTAGTGGAACCTCCGTCTG59.8720

P40GCGTTCCTTCCTTTGTCGTA60.2520CAAAAACTCCTCAATTCCTCACA60.5023

P51CCATTTGC