GB/T 39602-2020 牛结节性皮肤病诊断技术

ICS11.220

B41GB

中华人民共和国国家标准

GB/T39602-2020

牛结节性皮肤病诊断技术

DiagnostictechniquesforLumpyskindisease

2020-12-14发布2020-12-14实施

国家市场监督管理总局申＃

国家标准化管理委员会保叩

GB/T39602-2020

目次

前育”………………..m

引言”……………”……N

1范围………”……·……”…·…...........................1

2规范性引用文件…………”…”…·…1

3缩略语…“………·………1

4临床诊断…”………………·……1

4.1易感动物…………”…...........................1

4.2临床症状…··……“………·……..2

4.3病理变化………………·…...........................2

4.4结果判定……………”……·”2

5实验室诊断样品采集……··……“……2

5.1器材…”…………”………2

5.2试剂”………”…2

5.3样品采集………”………·……3

5.4样品的送检与保存………”………·……3

5.5样品处理…………”………·……3

6电镜观察…”……··…………·……4

6.1器材…”……··…………·………4

6.2试剂……·……”………·…4

6.3操作步骤……··…………·…4

6.4结果判定…·……”………·…4

7病毒分离与鉴定……·……”………·……4

7.1器材”…………4

7.2细胞与试剂……··……”………·……4

7.3病毒分离……………5

7.4病毒鉴定……··……“………5

8实时荧光聚合酶链式反应（实时荧光PCR)·······…··……”….....................5

8.1器材“……………5

8.2试弗j……·………“…·…5

8.3引物及探针………”…...........................5

8.4标准毒株和细胞……”………..6

8.5样品的处理……………·…….6

8.6病毒DNA的提取和纯化……………”…………6

8.7实时荧光PCR检测…………”……….6

8.8结果判定………”……7

9聚合酶链式反应（普通PCR方法）………·……………….7

I

GB/T39602-2020

9.1器材……….••••••••.••••••••••••7

9.2试剂………·……””……..7

9.3寻｜物……·……”……”……..8

9.4样本的制备”…..8

9.5PCR检测…·……””……..8

9.6结果判定……·……”……”……..9

10微量中和试验（VN)·······················………·……”……”……..9

10.l器材…·……”……”……..9

10.2细胞株…………..9

10.3标准毒株…··……””……..9

10.4操作步骤………”……”…·….........9

10.5阴阳性对照………………·…“…10

10.6结果判定…………”……10

10.7结果解释…………”………·………·…10

11综合判定……………·………·…10

11.1疑似…………”….10

11.2确诊…………”………·……10

附录A（规范性附录〉试剂的配和l…·………”………·……11

附录B（资料性附录〉引物扩增序列………”……………14

Il

GB/T39602-2020

前言

本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。

本标准对应于OIE最新公布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2018版）的3.4.12牛结节性皮肤

病（LSD）有关内容，且与该条标准的一致性程度为非等效。

本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。

本标准起草单位g中华人民共和国重庆海关、中国动物卫生与流行病学中心、中华人民共和国上海

海关、重庆澳龙生物制品有限公司。

本标准主要起草人z聂福平、李林、李应国、吴晓东、王星、杨俊、樊晓旭、王国民、李贤良、南文龙、

史梅梅、张雷

m

GB/T39602-2020

冒｜言

本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到8.3引物及探针中引物对2和探针2

与《牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒及检测方法》相

关的专利的使用。

本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。

该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且元歧视的条款和条件下，

就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下

联系方式获得z

专利持有人姓名z聂福平、王显、杨俊、李贤良、王国民、李应国。

地址g重庆市江北区红黄路8号。

请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专

利的责任。

N

GB/T39602-2020

牛结节性皮肤病诊断技术

1范围

本标准规定了牛结节性皮肤病（LSD)的临床诊断、实验室诊断技术和程序。

本标准适用于牛结节性皮肤病的诊断。病毒分离与鉴定适用于个体动物移动前的元感染证明或临

床病例确诊5电镜观察适用于临床病例确诊s实时荧光PCR与普通PCR适用于个体动物移动前的无感

染证明、临床病例确诊和监测感染流行率s血清中和试验适用于个体动物移动前的无感染证明、确诊临

床病例、监测感染流行率和免疫效果评估，

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本〈包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CPE，细胞病变（Cytopathiceffect)

DNA，脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid)

EDTA，乙二胶四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid)

GMEM，生长营养需要培养基（Glasgow’sModifiedEagle’sMedium]

LSD，牛结节性皮肤病（Lumpyskindisease)

LSDV，牛结节性皮肤病病毒（Lumpyskindiseasevirus]

LTc，羔羊辜丸细胞（Lambtestiscell)

ORF，开放阅读框（Openreadingframe)

PBS，磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline)

PCR，聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction)

TCID50，半数组织培养感染量（Mediantissuecultureinfectivedose)

Vero，非洲绿猴肾细胞（Africangreenmonkeykidneycell)

VN，病毒中和试验（Virusneutralisationtest)

4临床诊断

4.1易感动物

各种品种的牛，包括黄牛、奶牛、亚洲水牛、瘤牛、艳牛均易感，绵羊、山羊及野生动物长颈鹿、黑斑

势、长角辫羊可人工感染。

1

GB/T39602-2020

4.2I临床症状

4.2.1易感动物体温升高达41℃，持续1周～2周g鼻炎、结膜炎和唾液过度分泌s厌食，精神委顿，不

愿行走，泌乳奶牛产奶量显著减少囚

4.2.2易感动物全身皮肤、秸膜出现结节，以头、颈、乳房、腿部、背部、胸部、阴囊、外阴、会阴、眼险、耳

梢、口鼻秸膜及尾部尤为突出，结节大小不等，可聚成不规则的肿块，可波及全身皮肤、反下组织、肌肉

组织。

4.2.3易感动物口腔和消化道秸膜表面形成丘掺g全身体表淋巴结肿大3眼、鼻、口、直肠、乳房和生殖

器敬膜表面形成结节，并迅速溃烂。

4.2.4母牛流产与暂时性不孕；公牛罹患辜丸炎和附辜炎，暂时性或终生不育。

4.3病理变化

4.3.1患病动物皮肤表面可见直径。.5cm~5cm、深度1cm~2cm的皮肤结节，累及所有皮肤层、皮

下组织以及相邻的肌肉，并伴有充血、出血、水肿、血管炎和坏死s口腔、气管、生殖道和消化道秸膜（特别

是皱胃〉可能存在结节。

4.3.2皮肤、肌肉等结节附近发生炎症反应，结节下、教膜下、结缔组织或周围组织有浆液性渗出，皮下

组织水肿z咽、呼吸道、消化道、包皮、阴道、子宫壁的病变也有此特点。

4.3.3咽、舌和会厌以及整个消化道秸膜出现症样病变，鼻腔、气管和肺等秸膜出现症样病变s辜丸和

膀脱出现症样病变。

4.3.4结节切面为乳白色或自色，初期可渗出血清，2周内结节内可能出现锥形中央核或坏死组织／坏

死灶．

4.4结果判定

4.4.1易感动物出现上述临床症状和病理变化，可判为疑似牛结节性皮肤病。

4.4.2确诊应采集有临床症状动物的结节、抗凝血进行实验室诊断，或采集未见明显临床症状易感动

物的抗凝血、唾液、鼻眼分泌物进行实验室诊断。

5实验室诊断样晶采集

5.1器材

5.1.1手术剪刀和银子。

5.1.2灭菌样品保存管(15mL或50mL）。

5.1.3离心管（2mL,10mL）。

5.1.410mL~20mL灭菌注射器。

5.1.5防水标签．

5.1.6医用防护服。

5.1.7组织匀浆器。

5.1.8高速组织匀浆机。

5.2试剂

5.2.10.1mol/LPBS(pH7.4），按照附录A的A.I配制。

5.2.210%甘泊－PBS保存液，按照A.2配制。

5.2.3青霉素，终浓度为1000IU/mL。

2

GB/T39602-2020

5.2.4硫酸链霉素，终浓度为1mg/mLo

5.2.54国j霉菌素，终浓度为100IU/mL。

5.2.6两性霉素B，终浓度为2.51-'g/mLo

5.2.7新霉素，终浓度为200IU/mL。

5.2.8GMEM培养基。

5.3样晶采集

5.3.1皮肤结节采集

用0.1mol/LPBS(pH7.4）清洗皮肤结节表面，然后用灭菌手术剪刀剪取结节，2g~5g为宜。采

集到的皮肤结节装人样品保存管，加10%甘油PBS保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，冷冻

保存。

5.3.2组织样晶采集