GB/T 14924.11-2001 实验动物 配合饲料维生素的测定

GB/T14924.11一2001

前言

本标准的全部技术内容为推荐性的。

本标准从GB14924--1994实《验动物全价营养饲料》中分离出来，形成独立的标准。

本标准中所列两种方法具有同等效力。

本标准及其配套标准自实施之日起，代替GB14924-1994,

本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。

本标准起草单位:中国实验动物学会。

本标准主要起草人:周瑞华、王竹、石磊、王光亚、张瑜、郑陶、刘秀梅。

本标准由国家科学技术部委托技术归口单位中国实验动物学会负责解释。

本标准于1994年1月首次发布。

中华人民共和国国家标准

实验动物配合饲料

维生素的测定GB/T1492411--2001

代替GB149241991

Laboratoryanimals-Formulafeeds

-Determinationofvitamins

范围

本标准规定了实验动物配合饲料中维生素的测定方法，即配合饲料中维生素A、维生素E,维生素

B,、维生素B,烟酸、维生素Bfi、总抗坏血酸、总胆碱、叶酸、维生素B,、维生素K3、泛酸、生物素、维生素

D、的侧定方法

本标准适用于实验动物小鼠、大鼠、兔、豚鼠、地鼠、犬和猴的配合饲料及其原料的测定。

2引用标准

下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均

为有效。所有标准都会被修订，使用本标准时的各方应探讨使用下列标准的最新版本的可能性。

GB/T12388-199。食物中维生素A和维生素E的测定方法

GB/T12390-199。食物中硫胺素(维生素B,)的测定方法

GB/T12391-1990食物中核黄素的测定方法

GB/T12392-1990蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定方法荧光法和2,4一二硝基苯胺法

GB/T12395-1990食物中烟酸的测定方法

GB/T14700-1993饲料中维生素B,测定方法

GB/T14701-1993饲料中维生素Bz测定方法

GB/T17407-1998食物中维生素B。的测定

GB/T17812-1999饲料中维生素E的测定高效液相色谱法

GB/T17816-1999饲料中总抗坏血酸的测定邻苯二胺荧光法

GB/T17817-1999饲料中维生素A的测定高效液相色谱法

G13/T17818-1999饲料中维生素D:的测定高效液相色谱法

3测定方法

11配合饲料中维生素A和维生素E的测定

按GB/T12388,GB/T17812,GB/T17817的规定执行

3.2配合饲料中维生素B:的测定

按GB/T14700,GB/T12390的规定执行。

13配合饲料中维生素B:的测定

按GB/T12391,GB/T14701的规定执行。

中华人民共和国国家质It监督检验检疫总局2001-08-29批准2002-05-01实施

GB/T14924112001

34酉己合饲料中烟酸的测定

按GB/T12395规定执行

35配合饲料中维生素B。的测定

按(=B/r17307规定执行。

I6配合饲料中总杭坏血酸的测定

按GB/'r12392,GB/T17816规定执行

I了配合饲料中总胆碱的测定

3.7.1原理

配合饲料中的胆碱经过碱处理提取后，通过硅镁吸附3iJ(柱色谱纯化.然后用雷纳克盐(reineckate)

I胆碱反应生成粉红色的胆碱一雷纳克盐复合物。此复合物被丙酮洗脱后，在526nm有最大吸收其吸

收伎与胆碱浓度成正比。本方法检出限为。.1mg

3了.2试剂

所有试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

17.2.1甲醇

3.7-2.2三氯甲烷。

3.7-2.3乙酸甲醋。

17.2.4丙酮。

I了.2.510%丙酮取10ml，丙酮与90ml，水混合。

17.2.6冰乙酸。

3.7-2.了冰乙酸一甲醇溶液:取lom工冰乙酸和90ml甲醇混合。

3.7.2.8氢氧化钡。

3-7.29硅镁吸附剂(Florisil):60^-100目。

17.2.10提取液:于100ml甲醇中加人4-5g无水氢氧化钡，搅拌10min再加人lom工只氯甲烷

混合过滤去除多余的氢氧化钡。

3.7-2.11雷纳克馁盐(ammoniumreineckate)饱和溶液:称取2^3g雷纳克钱盐，加人looml水，搅

拌10min，过滤去除多余的雷纳克钱盐。实验当日配制。

17.2.12胆碱标准贮备液(5mg/mL):准确称取无水氯化胆碱0.5761g.溶解于水中.并定容至

100ml。冰箱保存。

3.7-2.13胆碱标准应用液((1.0mg/mL):准确吸取20.0m工标准贮备液，用水稀释并定容至100m工J

17.3仪器与设备

3.7.3.1实验室常用设备。

3.7.3.2回流提取装置。

3.7.3.3色谱柱:0.8cm(内径)X30cm的玻璃柱，柱上端为容积30-50mL的储液杯，底端收缩变

细，并装有活塞活塞上约1cm处有一玻璃筛板，筛板孔径为1630pm。使用前需干燥

3.7-3.4分光光度计

3-7.4测定步骤

3.7.41提取

称取适量样品(约含5^50mg胆碱)，置干100mL具塞锥型瓶中，加人40ml提取液、于76-

82C恒温水浴回流3h，回流速度为每秒1-2滴。冷却，样品过滤至100m〔容量瓶中，反复用5-

10mI.冰乙酸一甲醇溶液洗涤锥形瓶和滤渣，洗液并人容量瓶中，用冰乙酸调节pH至2-6,用甲醇定容

至刻度

3.7.4.2纯化

3.7.4.2门填装色谱柱:将干燥的硅镁吸附剂约4g浸人甲醇中，取干燥色谱柱，湿法将硅镁吸附剂填

Gs/T14924,11--2001

充人色潜柱中，至硅镁吸附剂的高度达10cm左右。用甲醇冲洗色谱柱并保持甲醇液面高于硅镁吸附

411-2cm，直至使用为止

3.7.4.2.2柱色谱纯化:吸取50m工的提取液，加到已填装好的色谱柱中，打开底端活塞，使提取液靠

重力作用流过色谱柱立即依次用5,10mL甲醇,2份10ml乙酸甲醋和10m1.10%丙酮洗涤色谱柱

接着加人5mL雷纳克钱盐饱和溶液通过色谱柱，用2份10ml冰乙酸洗涤，直至流出液清亮为止。少月

15ml丙酮洗脱色谱柱上胆碱一雷纳克盐复合物的粉红色色谱带，用25ml-具塞量筒收集全部洗脱液

并用丙酮定容至15m工。

3.了4.3比色测定:用分光光度计，于526nm波长下。以丙酮调节零点、测定样品吸光度值，在标币工

作曲线上查出胆碱含量，或用回归方程计算出相应的胆碱含量，求得计算结果。

3.7-4.4标准工作曲线:分别吸取0.50,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL标准应用液，相当于胆碱含量0.5,

1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mg，按照上述样品测定步骤操作。以胆碱含量做横坐标，以吸光度值为纵坐标绘

制标准工作曲线，并计算回归方程。

I7.5计算结果

见式(1)e

V,x100……，(1)

V

mcxx

式中:X-一样品中胆碱的含量,mg/100g;

。—从标准回归曲线上查得的胆碱含量,mg;

V—样品提取液定容体积，mL;

Vz一纯化用提取液的体积，mL;

M-—样品质量，9。

I了6结果的允许差

同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值<10%

3.8配合饲料中叶酸的v@9定—微生物法

3.8.1原理

叶酸是干酪乳酸杆菌(Lactobacilluscasei,L.C,ATCC7469)生长所必需的营养素。在一定条件下

L.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖强度用测定吸光度值表示。与标准曲线相

比较，计算出样品中叶酸的含量。本方法检出限为。.1ngo

3.8-2试剂

本实验用水均为蒸馏水。试剂纯度除特别注明外均为分析纯。

3.8-2.1甲苯。

3.8-2.2生理盐水:使用前需灭菌处理。

38.2,3菌种:干酪乳酸杆菌((Lactobacilluscasei,L.CATCC7469)

3.8-2.4磷酸缓冲液(0.05mol/LpH6.8):称取4.35g磷酸钠(Na,PO,·12H20),10.399磷酸氢二

钠(Na,HP0,"7H20)溶解于800mL水中。临用前加人约5g抗坏血酸，并调节pH至6.8

3.8-2.5鸡胰酶:称取100mg干燥的鸡胰酶，加人20ml磷酸缓冲液制成匀浆，3000r/min离心

10min，取上清液备用，临用前配制

I8-2}6蛋白酶一淀粉酶分别称取蛋白酶和淀粉酶各200mg，加人20m工，磷酸缓冲液制成匀浆，

3000r/min离心10min,，取上清液备用。临用前配制。

3.8-2,7氢氧化钠溶液(。.01mol/L):用20%乙醇配制。

18.2.8氢氧化钠溶液(10mol/L)o

3.8-2.9叶酸标准储备液(200lcg/mL):准确称取200mg叶酸标准品用。.01mol/L氢氧化钠溶液

溶解并定容至11。储存于棕色瓶中。

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18.2.10叶酸标准中间液(200ng/mL):吸取l.0mL叶酸标准储备液，用。.01mol/I氢氧化钠溶液

溶解井定容至11。储存于棕色瓶中。

3-8.2-11叶酸标准应用液(0.2ng/mL):吸取1.0m1叶酸标准中间液，用磷酸缓冲液稀释定容至

11。

18.2.12酶解酪蛋白:将8g碳酸氢钠溶解于1L水中，加人60g去维生素酪蛋白，用10moll氢氧

化钠溶液调节pH至8.。加人300mg胰酶，搅拌20min，使胰酶充分混匀。再加人2.5ml甲苯，置

37C'恒温箱酶解48-72h。将酪蛋白从恒温箱中取出，经121C高压30min以终止反应，去除甲苯冷

却，加log硅藻土(技术级)搅拌，用布氏漏斗过滤。滤液中加人约60mL冰乙酸调节pH至3.7。称取

活性炭12g，加至滤液中搅拌10min，用布氏漏斗过滤，重复三次每次过滤时，布氏漏斗内加log硅藻

土助滤。最后滤液用水稀释至1200mL,冰箱保存。取一小份酶解酪蛋白液进行干燥处理，如固体含量

小于40mg/m工，则需重新制备。

18.2.13黄嗓吟溶液:取。.4g黄嚷吟，加人lom工、氨水，加热溶解.用水稀释至100m工。冰箱保存

18.2.14腺嚓吟鸟嗓吟一尿11}1P"T溶液:分别称取硫酸腺嗓吟盐酸鸟嗦吟和尿rf92各。.2g，加人((1+

4)盐酸溶液，加热溶解，用水稀释至100m工室温贮存。

3.8-2.15乙酸缓冲液(1.7mol/I_,PH4.5):38.65g乙酸钠，19.8mL乙酸，加水至500ml

38.2.16维生素溶液:取10mg核黄素溶解于40mL乙酸缓冲液中。取。.2mg生物素，2.5mg碳酸

氢钠，20mg对氨基苯甲酸,40mg盐酸毗多醇，4mg盐酸硫胺素，8mg泛酸钙，8mg尼克酸溶解于

50ml.水中。将上述两种溶液混合，加水至100m工。

18.2.17吐温-80溶液:将2g吐温一8。加人100m工45C水中，混匀。

3.8-2.18还原v!1谷胧甘肤溶液:取。.1g还原ffll谷胧甘肤，加水溶解至100MI。

3.8-2-19甲盐溶液:称取5g磷酸氢二钾和2g磷酸二氢钾，加水溶解至100mL，液面L加人少许甲

苯以保存之

3.8-2-20乙盐溶液:称取2g硫酸镁，0.5g硫酸亚铁和。.5g硫酸锰，加水溶解至100m工，液面上加

少许甲苯以保存之

3.8-2-21基础培养基:酶解酪蛋白100m工_，腺嚷岭鸟a吟一尿嗜吮溶液2.5m工_，黄91岭溶液2.5m工_，

维生素溶液5mL，吐温-80溶液2.5mL,L一天冬氨酸。·3g,L-盐酸半胧氨酸。2g，还原型谷胧甘肤溶

液2.5m工，葡萄糖20g，乙酸钠20g，甲盐溶液2.5mL，加水至250mL，搅拌，用氢氧化钠溶液调节pH

至6.8士。.]，然后加人乙盐溶液2.5ml，磷酸缓冲液200ml-，用水补至500mL冰箱内可保存一周。

18.2.22琼脂培养基葡萄糖1g，蛋白陈0.8g,酵母提取物于粉。.2g，乙酸钠(NaAc"3H,0)

1.7g，甲盐溶液。.2mL，乙盐溶液。.2ml，琼脂1.2g加水至100mL,置水浴煮至琼脂完全熔化，调节

pH至6.8士。1。尽快倒人试管中，每管3-5ml，塞上棉塞，121C高压灭菌15min，取出后直立试管，

冷却至室温，于冰箱内保存

3.8.3仪器与设备

18.3门实验室常用设备。

3.8-3.2恒温培养箱。

3.8.13离心机。

3.8.3.4高压消毒锅。

3.8-3.5震荡器。

18.3.6接种针和接种环

3.8.17分光光度计。

I8.4菌种制备与保存

18.4.了储备菌种的制备:将L-C纯菌种转接至2个或多个琼脂培养基管中。(37士。.5)C恒温培养

箱中培养16^24h。贮于冰箱内，侮周转种一次留作储备菌种

BGr/'1492411一2001

18.4.2种子培养液的制备:取2m工叶酸标准应川液和10ml_基础培养基，混匀，分装至4支5m1

离心管中，塞r.棉塞.121C高压灭菌15min，备ltl

18.5测定步骤(所有操作均需避光进行)

I8.5门接种液的制备:使用前一天，将菌种由储备菌种管中转种至2支已灭菌的种子培养液中，(37

生0.5)(恒温培养箱中培养16^-24h。次日晨混悬种子培养液，无菌操作下吸取0.2m工，将细菌转种

至另2支灭菌的种子培养液中，(37士。.5)C再培养61,。取出3000r/mii，离心10min，倾去上清液，用

已火菌的生理盐水清洗二次，离心.弃去L清液。最后加sm工、生理盐水，震荡棍匀，制成1f种混悬液。h'_

即使用。

38.5.2样品制备

18.5.2.1样品处理:将样品磨成粉末

18.5.2.2水解:称取。.1-0.58样品(约含叶酸100-300ng〕于100mL锥形瓶中，加人50mL磷

酸缓冲液，混匀121C高压水解15min,

18.5.2-3酶解:水解样品冷却后，加入1m1鸡胰酶,1ml蛋白酶一淀粉酶,Im工甲苯，充分混合(37

}-0.5)C恒温培养箱中酶解16--20h。取出酶解样品用水定容至100mL，过滤。取2mL滤液稀释至

20nli，使叶酸终含量在。.1-0.3ng/mI范围之内。同时另取一支试管，加人1nil鸡胰酶,1ml)蛋白

酶淀粉酶，作酶空白对照

18.5.3标准系列管的制备

取2组平行试管，每管分别加人叶酸标准应用液0.0,0.5.1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL，相当于叶酸

含袱。.1.0.'?,0.4,0.6,0.8,1.0ng，加水补至5.0ml，再加5mL基础培养基，混匀。

18.5.4样品管的制备

取4组试管，每管分别加人酶解样品1.0,2.0,3.0.4.0ml，补充水至体积为5.0ml，再加5ml.基

础培养纂.混匀。

3.8.5.5灭菌:将以上标准系列管、样品管和酶空白管全部塞上棉塞，121C高压灭